宋書會 王汝健 辛 宇 張金堯 汪 洪

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，國家化肥質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(北京)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全肥料源性因子風(fēng)險評估實驗室(北京)，北京 100081)

前言

土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是作物的主要氮素來源，兩者通過硝化作用和反硝化作用相互轉(zhuǎn)化[1-2]。氮肥主要分為銨態(tài)氮肥和硝態(tài)氮肥，過量施用氮肥導(dǎo)致農(nóng)田銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量超標(biāo)，影響土壤質(zhì)量，甚至流失，對周圍環(huán)境和人體健康帶來危害[3-4]。

全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(酶標(biāo)儀)是在多孔陣列微孔板中加樣，由計算機控制，設(shè)置特定波長，快速讀取微孔板內(nèi)樣品顯色后的吸光度，該儀器設(shè)備適于大批量樣品分析，操作簡便。用于土壤浸提液中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的測定，還缺少深入研究。本研究的目的是采用酶標(biāo)儀結(jié)合比色法分析測定土壤樣品中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。旨在建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的測定土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備

Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(酶標(biāo)儀，Thermo Scientific公司)、AutoAnalyzer 3連續(xù)流動分析儀(SEAL Analytical, ltd.公司)。

1.2 試劑

1.2.1 硝態(tài)氮

顯色劑：取5.00 g磺胺溶解于300 mL去離子水中，加入0.25 g N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(C10H7NH2CHCH2NH2·2HCl，NEDD)，并混合均勻，加入50 mL磷酸，稀釋定容至500 mL，儲存于棕色瓶中。

硫酸銅溶液：稱取0.10 g五水合硫酸銅溶于60 mL去離子水中，攪拌溶解后，轉(zhuǎn)移定容至100 mL，搖勻。

硫酸鋅溶液：稱取1.00 g七水合硫酸鋅溶于60 mL去離子水中，攪拌溶解后，轉(zhuǎn)移定容至100 mL，搖勻。

硫酸肼溶液(3.0 g/L)：稱取0.6 g硫酸肼(N2H4·H2SO4)完全溶解于120 mL去離子水中，加入2.8 mL硫酸銅溶液和2.0 mL硫酸鋅溶液，去離子水定容至200 mL，搖勻。

氫氧化鈉溶液：稱取16.0 g氫氧化鈉，溶解于400 mL水中，混勻。

緩沖溶液：量取6.0 mL磷酸于400 mL去離子水中，加入8.00 g十水二磷酸鈉攪拌溶解，用去離子水定容至2 000 mL，混合均勻。

硝酸鉀儲備溶液(100 mg/L)：稱取0.100 0 g硝酸鉀溶于600 mL中，去離子水定容至1 000 mL，混勻。

1.2.2 銨態(tài)氮

二氯乙氰尿酸鈉溶液(連續(xù)流動分析儀)：稱取4.00 g 氫氧化鈉，0.60 g二氯乙氰尿酸鈉(C3Cl2N3NaO3，DIC)試劑溶入約120 mL去離子水中，定容至200 mL，混勻。

水楊酸鈉溶液：稱取8.00 g水楊酸鈉溶入約120 mL去離子水中，加入0.20 g硝普鈉，定容到200 mL，混勻。

緩沖溶液：稱取10.0 g氫氧化鈉，7.06 g七水合磷酸氫二鈉，31.8 g十二水合磷酸鈉溶于約600 mL去離子水中，加入10 mL次氯酸鈉，混合均勻，去離子水定容至1 000 mL，混勻。

苯酚溶液(酶標(biāo)儀)：10.0 g苯酚溶解于約600 mL去離子水中，加入0.10 g硝普鈉，攪拌溶解后定容至1 000 mL，混合均勻。

緩沖溶液：稱取40 g檸檬酸鈉溶解于600 mL水中，定容至1 000 mL，混勻。

氯化銨儲備溶液(100 mg/L)：稱取0.100 0 g氯化銨溶于約600 mL去離子水中，攪拌溶解后定容至1 000 mL，混合均勻。

氯化鉀浸提液：稱取74.55 g氯化鉀溶于800 mL去離子水中，攪拌溶解，定容至1 000 mL，混勻。

實驗中配制試劑時，可根據(jù)實際樣品量調(diào)整試劑配制量，如未特殊說明，所用試劑均為分析純。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別量取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL氯化銨儲備溶液，用水定容至50.0 mL，即濃度為0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L的銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液。

硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別量取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL硝酸鉀儲備溶液，用水定容至50.0 mL，即濃度為0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/L的硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 實驗

分別稱取10.0 g供試土壤于500 mL具螺旋蓋聚乙烯瓶中，加入100 mL氯化鉀浸提液，200 r/min室溫下震蕩1 h，過濾收集濾液。

1.3.2 平行

取6份土壤樣品，做與實驗組相同的浸提處理，每份土壤做4組平行。通過酶標(biāo)儀對平行組樣品測定，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析酶標(biāo)儀測定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量的精密度。

1.3.3 測定

使用AA3連續(xù)流動分析儀測定實驗組浸提液中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮濃度。

酶標(biāo)儀測定銨態(tài)氮含量：取待測液100 μL加入50 μL緩沖液和50 μL苯酚溶液，避光顯色反應(yīng)1 h后，在625 nm波長下測量吸光度。

酶標(biāo)儀測定硝態(tài)氮含量：取待測液40 μL加入40 μL氫氧化鈉溶液和40 μL硫酸肼溶液，封口膜封緊酶標(biāo)板，反應(yīng)20 min后，加入80 μL緩沖液和40 μL顯色劑在550 nm波長下測定吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：分別按照上述試劑加入量用酶標(biāo)儀測定銨態(tài)氮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和硝態(tài)氮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。

銨態(tài)氮加標(biāo)回收測定：取待測液(6組)50 μL三份，依次加入50 μL 0.20、0.40、0.60 mg/L的銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，用酶標(biāo)儀測定吸光度。

硝態(tài)氮加標(biāo)回收測定：取待測液(6組)20 μL三份，依次加入20 μL 2.00、4.00、6.00 mg/L的硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光度。計算加標(biāo)回收率，分析酶標(biāo)儀測定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的準(zhǔn)確度。

檢出限實驗：根據(jù)12份空白組測定結(jié)果，3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差[16]作為檢出限估計值，分析酶標(biāo)儀測定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮檢出限。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶標(biāo)儀法測定的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

圖1 酶標(biāo)儀法測定銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Figure 1 Standard curve of determined by the proposed colorimetric method with a microplate reader.

圖2 酶標(biāo)儀法測定硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Figure 2 Standard curve of determined by the proposed colorimetric method with a microplate reader.

2.2 酶標(biāo)儀法測定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的方法檢出限

2.3 酶標(biāo)儀測定硝態(tài)氮過程中還原劑硫酸肼濃度的確定

圖3 不同硫酸肼濃度下標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Figure 3 Standard curve of measurement with different concentrations of hydrazine sulfate.

2.4 精密度實驗

表1 酶標(biāo)儀測定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

Table 2 Relative standard deviation (RSD) of theproposed colorimetric method with a microplate

樣品編號NO-3-N 含量/(mg·L-1)平均值/(mg·L-1)RSD/%13.1993.1073.1573.2353.1751.721.7161.6241.7571.7821.7204.031.7721.7541.6421.6501.7044.041.7051.7651.6121.7821.7164.552.6092.7762.7742.7222.7202.961.7141.7581.7771.6371.7213.6

2.5 酶標(biāo)儀與連續(xù)流動分析儀測定結(jié)果比較

圖4 連續(xù)流動分析儀和酶標(biāo)儀對含量的測定結(jié)果Figure 4 Results of in soil extracts determined by the continuous flow analyzer and the proposed colorimetric method with a microplate reader.

圖5 連續(xù)流動分析儀和酶標(biāo)儀對含量的測定結(jié)果Figure 5 Results of in soil extracts determined by the continuous flow analyzer and the proposed colorimetric method with a microplate reader.

圖6 連續(xù)流動分析儀與酶標(biāo)儀測定結(jié)果相關(guān)分析Figure 6 Relationship between concentrations in soil extracts determined by the continuous flowanalyzer and theproposed colorimetric method with microplate reader.

圖7 連續(xù)流動分析儀與酶標(biāo)儀測定結(jié)果相關(guān)分析Figure 7 Relationship between concentrations in soil extracts determined by the continuous flow analyzer and the proposed colorimetric method with microplate reader.

2.6 酶標(biāo)儀法測定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的加標(biāo)回收率

表3 酶標(biāo)儀法測定和加標(biāo)回收率

2.7 兩種儀器使用的比較

3 結(jié)論

酶標(biāo)儀測定土壤中的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在 10% 以下，且該方法測定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮回收率分別在96.2%～108.0%和94.9%～110.0%之間；與連續(xù)流動分析儀法測定結(jié)果之間沒有明顯差異，相關(guān)性較高。鑒于酶標(biāo)儀消耗試劑少，分析速度快的優(yōu)點，可適于大批量土壤中無機氮的快速分析測定。