焦艷

[摘要] 目的 分析P37、P16、PAX-2在子宮內膜增生癥中的表達及其意義。 方法 收集2012年12月～2017年8月河北省秦皇島市婦幼保健院接受病理活檢，并經(jīng)病理組織學活檢確診為子宮內膜增生患者的病理組織標本，其中單純型及復雜型子宮內膜增生標本31個、不典型子宮內膜增生組織標本30個;另選取30個正常子宮內膜組織標本作為對照。采用免疫組化SP法檢測不同組織標本中P37、P16及PAX-2蛋白陽性表達率。 結果 正常子宮內膜組織中未見P37蛋白陽性表達，不典型增生癥組織中陽性表達率高于單純型或復雜型增生癥，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;不典型增生組織中P16蛋白陽性表達<單純型或復雜型增生<正常子宮內膜組織，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）;不典型增生組織中PAX-2蛋白陽性表達<單純型或復雜型增生<正常子宮內膜組織，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 結論 P37、P16、PAX-2在不典型子宮內膜增生中均有一定異常表達，值得進一步深入探究。

[關鍵詞] P37;P16蛋白;PAX-2;子宮內膜增生癥

[中圖分類號] R711.74? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（b）-0084-04

[Abstract] Objective To analyze the expression and significance of P37， P16 and PAX-2 in endometrial hyperplasia. Methods From December 2012 to August 2017， in Qinhuangdao Maternal and Child Health Hospital， the pathological tissue specimens of patients with endometrial hyperplasia diagnosed by pathological biopsy were selected， including 31 specimens of simple and complicated endometrial hyperplasia and 30 specimens of atypical endometrial hyperplasia; 30 normal endometrium specimens were selected as controls. The positive expression rates of P37， P16 and PAX-2 protein in different tissue specimens were detected by immunohistochemical SP method. Results There was no positive expression of P37 protein in normal endometrium tissues， the positive expression rate in atypical hyperplasia was higher than simple or complex hyperplasia， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression of P16 protein showed atypical dysplasia tissue < simple or complex hyperplasia < normal endometrium tissue， the difference was statistically significant （P < 0.01）， while the positive expression of PAX-2 protein showed atypical dysplasia < simple or complex hyperplasia < normal endometrium tissue， the difference was statistically significant （P < 0.01）. Conclusion There exists abnormal expression of P37， P16 and PAX-2 in atypical endometrial hyperplasia， which is worthy of further study.

[Key words] P37; P16 protein; PAX-2; Endometrial hyperplasia

子宮內膜增生的發(fā)生系因長期無孕激素拮抗的雌激素作用所致，是非生理性、非侵襲性的內膜增生現(xiàn)象，因腺體大小、形態(tài)、腺體與間質比例的改變而導致子宮內膜量表達增加[1-2];而依據(jù)其增生程度不同，又分為增生內膜、簡單增生、復雜增生、不典型增生四個等級，其中增生內膜、簡單及復雜型內膜增生皆為不伴不典型的子宮內膜增生，預后一般良好;而不典型增生被認為是子宮內膜癌癌前病變，其臨床診治難度大，且預后相對較差[3-4]。

P37蛋白是豬鼻支原體的主要免疫原，既往有報道指出P37蛋白作為原核細胞微生物，其不僅多種疾病密切相關，在腫瘤疾病的發(fā)生、侵襲、轉移中亦發(fā)揮重要價值[5];P16基因則是由INA4a-ARF位點編碼的MTS-1基因，系抑癌基因的一種，可直接參與細胞生長增殖及分裂負調控過程，其基因編碼產(chǎn)物P16蛋白定位于細胞核蛋白，是細胞周期依賴激酶抑制劑2A，對細胞分裂周期關鍵酶CDK4的合成、催化活性均有抑制作用，一旦P16蛋白低表達、失表達便可引起細胞周期紊亂、細胞生長失去控制，最終產(chǎn)生惡變，形成腫瘤[6]。而PAX-2則是PAX家族成員之一，通常情況下，是腫瘤細胞生存所必須的條件之一，有研究指出其在子宮內膜癌中有異常表達現(xiàn)象，但關于其具體表達卻存異議[7-8]。鑒于此，本研究收集子宮內膜增生標本，對P37、P16、PAX-2蛋白在子宮內膜增生癥中的表達及意義進行研究，旨在進一步補充及完善子宮內膜不典型增生的臨床診治，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年12月～2017年8月在河北省秦皇島市婦幼保健院（以下簡稱“我院”）接受病理活檢并經(jīng)病理組織學活檢確診為子宮內膜增生患者的病理標本，所有患者既往均無子宮內膜增生相關治療史。其中單純型及復雜型子宮內膜增生標本31個（單純型16個，復雜型15個）、不典型子宮內膜增生組織標本30個;另選取30個正常子宮內膜組織標本作為對照，這些組織標本均來自同期于我院就診的子宮脫垂、子宮頸癌患者的正常子宮內膜組織。所有病理組織標本固定后均采用梯度酒精（低～高）充分脫水，并用石蠟包埋，按4 μm厚度連續(xù)切片，使組織充分緊貼于硅化載玻片，完成脫水、石蠟包埋、制片后封存。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學SP法

SP試劑盒來自北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：512821CB。取病理組織標本置于恒溫箱烘烤，溫度60℃、時長30 min，烘烤后再將標本置于純二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中浸泡，時長30 min，再采用梯度酒精溶液浸泡，浸泡順序由高到底，再用PBS液（0.01 mol/L PBS粉+1000 mL蒸餾水，pH值7.2～7.4）充分洗滌，5 min/次，重復PBS洗滌3次;3%過氧化氫溶液滅活內源性過氧化物酶后，按5 min/次PBS液沖洗3次后抗原修復，將檸檬鹽酸抗原修復液置于壓力鍋大火加熱煮沸，再放入組織標本后繼續(xù)加熱，直至減壓閥噴氣，噴氣1～2 min后室溫下冷卻，再次按5 min/次PBS液沖洗3次;抗原修復后分別滴加一抗（鼠抗人P16單克隆抗人來自北京中杉金橋生物技術有限公司生產(chǎn);抗P37單克隆抗體PD4為本研究組自制，兔抗人PAX-2單克隆抗人來自cell signaling公司）室溫孵育60 min，按5 min/次PBS液沖洗3次后二抗孵育，室溫下孵育20 min，再次PBS沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次后DAB（DAB試劑盒來自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司生產(chǎn)）底物顯色，室溫、暗盒下觀察顯色情況，5～10 min后終止顯色反應，再用蘇木精染色2～5 min，蒸餾水沖洗后滴加1%鹽酸酒精分化，再次蒸餾水沖洗5～10 min后氨水返藍，常規(guī)梯度酒精脫水、純二甲苯透明、中性質樹膠封片后鏡檢、拍照。

1.2.2 免疫組化染色結果判定

每張切片隨機選取5個視野，單個視野計數(shù)100個細胞，高倍顯微鏡（200倍）下觀察細胞計數(shù)。

1.2.2.1 P37、P16蛋白陽性表達? 按染色組織陽性細胞所占細胞的百分比評價陽性表達，依次為陰性（細胞核、細胞漿內均無棕色顆粒、或出現(xiàn)與背景相似的棕黃色顆粒）、弱陽性（細胞核或細胞漿內可見棕黃色顆粒，陽性百分比為5%～30%）、陽性（細胞內有棕黃色顆粒，比例為>30%～60%）、強陽性（細胞內有顏色較深、分布廣泛的棕黃色顆粒，比例>60%），陽性、強陽性視為陽性表達，其中PAX-2陽性細胞為棕黃色或棕褐色顆粒。

1.2.2.2 PAX-2蛋白陽性表達? 以細胞胞核或細胞胞漿內可見深黃色或棕黃色顆粒為陽性反應，高倍顯微鏡下隨機選取5個視野，其中細胞核內無著色計0分、細胞核內見淺黃色顆粒計1分、細胞核內見棕黃色顆粒計2分、細胞胞核內見棕褐色顆粒計3分;染色細胞比例不足10%計0分、10%～25%計1分、>25%～50%計2分、>50%計3分，以細胞核著色強度、染色細胞比例乘積>3分為PAX-2蛋白陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

子宮內膜增生癥組織中P37蛋白表達為棕黃色，位于細胞漿內，而P16蛋白在子宮內膜增生癥組織中均大量定位于組織細胞胞漿內，經(jīng)免疫組化染色法可見細胞漿內染色為棕褐色或棕黃色，PAX-2蛋白在子宮內膜間質細胞中位于細胞胞核，以棕褐色著色為陽性表達。

正常子宮內膜組織中未見P37蛋白陽性表達，不典型增生癥中陽性表達率高達43.33%，單純型或復雜型增生癥組織中偶見陽性表達，表達率為9.67%，兩種子宮內膜增生癥患者的子宮內膜組織中P37蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;正常子宮內膜組織中P16蛋白均呈陽性表達，單純型或復雜型增生組織中陽性表達率為87.09%，P16蛋白陽性表達情況：不典型增生組織（70.00%）<單純型或復雜型增生組織<正常子宮內膜組織，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2 =12.262，P < 0.01）;而PAX-2蛋白在不典型增生組織陽性表達為33.33%，單純型或復雜型增生為67.74%，正常子宮內膜組織則高達96.67%，PAX-2陽性表達情況：不典型增生組織<單純型或復雜型增組織<正常子宮內膜組織，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2 =26.855，P < 0.01）。見圖1～3（封四），表1。

3 討論

子宮內膜不典型增生是子宮內膜癌癌前病變，子宮切除、子宮切除+雙附件切除等外科手術方案雖能取得一定治療獲益，但于有生育要求的子宮內膜增生患者，外科手術切除導致其失去生育功能[9]。隨著當今對腫瘤基因、腫瘤分子生物學的研究日漸深入，多種癌基因、抑癌基因在腫瘤疾病的發(fā)生、轉移、侵襲中發(fā)揮的重要作用已引起臨床重視，為腫瘤疾病的早期診斷、預后評估及治療提供了新方向[10]。P37不僅是豬鼻支原體的主要免疫原，也是高親和力運輸系統(tǒng)的一部分，可誘導外周血單核細胞釋放腫瘤壞死因子，也可與細胞骨架蛋白NORPEG產(chǎn)生相互作用力，既往有研究表明[11]，經(jīng)轉染P37基因的AGS細胞形態(tài)顯著變小、變圓，細胞間黏附能力降低，并最終通過對細胞形態(tài)、細胞間黏附能力的影響改變細胞影響、運動、黏附能力，與腫瘤細胞轉移、生物個體發(fā)育有密切關聯(lián)。本研究顯示，正常子宮內膜組織中未見P37蛋白陽性表達，單純型或復雜型增生癥中偶見陽性表達，表達率僅為9.67%，而不典型增生癥中陽性表達率高達43.33%;Gomersall等[12]的研究也得出類似結論，認為P37蛋白可激活TLR4受體，誘導癌癥進展的基因表達，其研究還指出P37蛋白或可通過對腫瘤相關炎癥因子的調控影響腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移。而子宮內膜不典型增生作為子宮內膜癌癌前病變，P37異常陽性表達或可促進疾病進展至子宮內膜癌。

基于細胞分子生物學角度，細胞惡性腫瘤病變的本質系因細胞周期紊亂導致細胞生長增殖及凋亡失控所致;而P16蛋白是抑癌基因的一種，不僅直接參與細胞生長增殖，也阻止細胞周期從G期進入S期，從而對細胞有絲分裂進行負調控[13]，本研究顯示，正常子宮內膜組織中P16皆呈陽性表達，而在單純型或復雜型增生、不典型增生組織中呈遞減表達趨勢，提示P16蛋白表達異常，細胞增殖、分裂負調控失控，提示P16蛋白表達缺失或在疾病惡性病變中發(fā)揮一定作用，這與陸萍等[14]的報道有類似指出，其研究指出，正常子宮內膜組織、不典型增生、子宮內膜癌中均有陽性表達，且正常子宮內膜組織中P16蛋白陽性表達顯著高于子宮內膜癌;但楊小風等[15]卻報道，在宮頸組織中，P16蛋白陽性表達卻呈現(xiàn)不同趨勢，其報道中子宮上皮內瘤變Ⅰ級中P16蛋白陽性表達僅為12.50%，而子宮上皮內瘤變Ⅱ級、Ⅲ級及子宮頸癌卻分別高達84.60%、100.00%、100.00%。

同時，既往研究中，PAX-2蛋白在泌尿生殖系統(tǒng)相關疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，多種腫瘤疾病中均有陽性表達[16]，而本研究中不典型增生組織中PAX-2蛋白陽性表達（33.33%）<單純型或復雜型增生（67.74%）<正常子宮內膜組織（96.67%），差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），提示PAX-2蛋白或可隨病變程度的加重出現(xiàn)缺失加劇現(xiàn)象;張彤等[17]在增生期子宮內膜中陽性表達高達95.45%，在單純型子宮內膜增生、復雜性子宮內膜增生中陽性表達依次為71.42%、70.00%，在非典型性增生中陽性表達卻僅為38.70%，這與本研究所得結論趨勢一致，但當前關于PAX-2蛋白在子宮內膜增生癥中的功能及其相關機制研究仍相對罕見，還需進一步深入探究[18-20]。

綜上所述，P37、P16、PAX-2在不同類型的子宮內膜增生癥中表達均有一定差異，在子宮內膜癌癌前病變中存在過表達或表達缺失現(xiàn)象，鑒于當前P37、P16蛋白、PAX-2在子宮內膜增生癥中的表達及其意義類報道相對少見且研究所得結論的差異性，其具體機制仍需進一步深入探究。

[參考文獻]

[1]? 胡衛(wèi)華，徐丹，嚴永旭.芬嗎通雌激素經(jīng)陰道給藥與口服補佳樂作用子宮內膜增生的效果分析[J].安徽醫(yī)學，2014， 35（12）：1651-1653.

[2]? 王海波，趙金榮，逯彩虹，等.肥胖婦女絕經(jīng)后無癥狀子宮內膜增厚患者臨床病理分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2015，25（31）：88-91.

[3]? 楊明珠，李亞軍，王文素.絕經(jīng)后子宮內膜增厚人群子宮內膜癌相關因素探討[J].中日友好醫(yī)院學報，2015，29（3）：166-168.

[4]? 何翊姣，彭俊，彭爾清，等.子宮內膜增生及早期子宮內膜腺癌行孕激素治療的臨床分析[J].醫(yī)學研究雜志，2015， 44（8）：155-158.

[5]? Cruz PMR，F(xiàn)inlayson S，Morrow JM，et al. P37 Muscle MRI in congenital myasthenics syndromes [J]. Neuromuscular Disord，2014，24（Suppl 1）：S16-S17.

[6]? Yoon G，Koh CW，Yoon N，et al. Stromal p16 expression is significantly increased in endometrial carcinoma [J]. Oncotarget，2016，8（3）：4826.

[7]? ?rbo A，Arnes M，Lys? ?LM，et al. Expression of PAX2 and PTEN correlates to therapy response in endometrial hyperplasia [J]. Anticancer Res，2015，35（12）：6401-6409.

[8]? Stewart CJ，Crook ML. PAX2 and cyclin D1 expression in the distinction between cervical microglandular hyperplasia and endometrial microglandular-like carcinoma： a comparison with p16，vimentin，and Ki67[J]. Int J Gynecol Pathol，2015，34（1）：90-100.

[9]? 唐世倩，李慧，張宇迪，等.子宮內膜非典型增生及早期子宮內膜癌患者保留生育功能的相關研究進展[J].北京醫(yī)學，2015，37（7）：680-683.

[10]? 李衛(wèi)華，曹冬焱，沈鏗，等.子宮內膜不典型增生及早期子宮內膜癌保守治療失敗患者臨床分析[J].生殖醫(yī)學雜志，2015，24（9）：697-702.

[11]? Wu J，Wu L，Cheng F，et al. Mycoplasmal lipoprotein p37 binds human protein HER2 [J]. Microbiol Res，2016， 192：253.

[12]? Gomersall AC，Phan HA，Iacuone S，et al. The Mycoplasma hyorhinis p37 protein rapidly induces genes in fibroblasts associated with inflammation and cancer [J]. PLoS One，2015，10（10）：e0140753.

[13]? 王冬，崔俊琪，馬愛國，等.P16、P63、PAX-2在子宮內膜癌中的作用及臨床意義[J].中國生育健康雜志，2015， 26（s1）：35-37.

[14]? 陸萍，王一，張燕，等.子宮內膜癌標志物表達及其臨床意義研究[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2017，33（6）：636-640.

[15]? 楊小風，劉芳，武明莉，等.p16和Ki-67蛋白在宮頸組織中的表達及其對宮頸早期癌變的預警作用[J].廣東醫(yī)學，2017，38（17）：2641-2644.

[16]? 孟軼婷，馬東林，李莉，等.PAX-2和PTEN在子宮內膜病變中的表達及其與子宮內膜上皮內瘤變的相關性[J].腫瘤研究與臨床，2017，29（1）：27-31.

[17]? 張彤，沈丹華，陳云新，等.PTEN、PAX-2和β-catenin在Ⅰ型子宮內膜癌及其癌前病變中的表達及意義[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2014，23（2）：85-88.

[18]? 李麗，吳玉斌，徐海生，等.沉默PAX2基因對腎間質纖維化大鼠的影響[J].中國當代兒科雜志，2016，18（6）：551-557.

[19]? Maricich SM，Herrup K. Pax-2 expression defines a subset of GABAergic interneurons and their precursors in the developing murine cerebellum [J]. Dev Neurobiol，2015，41（2）：281-294.

[20]? Cai Y，Brophy PD，Levitan I，et al. Groucho suppresses Pax2 transactivation by inhibition of JNK-mediated phosphorylation [J]. Embo J，2014，22（20）：5522-5529.

（收稿日期：2018-08-13? 本文編輯：蘇? ?暢）