龔定芳，熊祎楠，孫佼文，史仲平

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

二十二碳六烯酸(DHA)是一種重要的ω-3系列多不飽和脂肪酸，對(duì)智力和視網(wǎng)膜的發(fā)育有重要影響[1]。研究表明DHA能抑制癌細(xì)胞增殖、抵御炎癥、預(yù)防心血管疾病，同時(shí)還具有抗皺保濕、防衰老等作用[2]。傳統(tǒng)的深海魚油DHA受到季節(jié)限制、環(huán)境影響，產(chǎn)品性質(zhì)不穩(wěn)定且?guī)в恤~腥味[3]。裂殖壺菌是一種海洋真菌，因DHA含量高、生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)、無(wú)毒無(wú)污染等諸多優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。野生型裂殖壺菌的DHA產(chǎn)量較低，難以滿足工業(yè)化需求。誘變育種是篩選優(yōu)良菌種的主要手段。

常壓室溫等離子體(ARTP)誘變通過(guò)釋放活性粒子，作用于微生物的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，使其結(jié)構(gòu)和通透性發(fā)生變化，引起基因損傷致使突變[4]。與傳統(tǒng)誘變方法相比，ARTP誘變育種具有突變率高、操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)。袁軍等[5]通過(guò)ARTP誘變，2，2′- 聯(lián)吡啶平板篩選成功獲得高產(chǎn) DHA 的菌株，DHA產(chǎn)量達(dá)到7.31 g/L，比初始菌株提升了29.8%。

本文以裂殖壺菌SR21為出發(fā)菌株，利用ARTP誘變，結(jié)合丙二酸、碘乙酸及丙二酸-碘乙酸混合平板的方式進(jìn)行篩選，并以搖瓶培養(yǎng)的方式考察突變株積累DHA的水平，以期獲得一株高產(chǎn)DHA的菌株。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

裂殖壺菌菌株(SchizochytriumlimacinumSR21)：購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)，-80℃保存于ATCC By+790培養(yǎng)基中?；罨囵B(yǎng)基：ATCC By+790固體培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：葡萄糖 30 g/L，酵母粉6 g/L，魚粉蛋白胨6 g/L，pH自然，121℃滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：參考文獻(xiàn)[6]配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

將保藏于-80℃條件下的菌種轉(zhuǎn)接于菌種活化平板上，25℃條件下培養(yǎng)3 d。接種環(huán)刮取一環(huán)，接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，25℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。以10%的接種量接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，搖瓶發(fā)酵120 h。

1.2.2 生物量及葡萄糖質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[7]測(cè)定生物量及葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.2.3 油脂提取

油脂提取：準(zhǔn)確稱取0.05 g菌體于10 mL具塞玻璃試管中，加入1.5 mL蒸餾水，混勻后加入2 mL鹽酸；65℃水浴至菌體完全消化，冷卻至室溫后加入2 mL正己烷-乙醇(2∶1)溶液，搖勻后靜置分層，取上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至新的10 mL玻璃試管中，試管提前稱重，用正己烷-乙醇溶液重復(fù)洗滌3次，將有機(jī)相合并后，充氮去除溶劑，得到油脂。

1.2.4 脂肪酸組成分析

脂肪酸甲酯化：參照文獻(xiàn)[8]。向待測(cè)油脂樣品中加入內(nèi)標(biāo)物1 mg/mL十九烷酸1 mL，加入0.5 mol/L NaOH-CH3OH溶液1 mL，60℃水浴振蕩至油珠完全溶解，冷卻后加入14% BF3-乙醚溶液2 mL，60℃水浴酯化20 min，冷卻后加入2 mL正己烷，振搖，渦旋2 min，加入2 mL飽和NaCl溶液振搖，靜置。取1 mL上層有機(jī)相于1.5 mL EP管中，加入少許無(wú)水Na2SO4以除去微量的水，離心后將樣品稀釋25倍后裝于棕色瓶待測(cè)。

利用氣相色譜(日本島津GC-2010PLUS)對(duì)脂肪酸進(jìn)行定量分析，色譜柱Rtx-WAX(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，色譜測(cè)定條件參照文獻(xiàn)[7] 。

1.2.5 單細(xì)胞菌懸液的制備及ARTP誘變

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌體接種到鋪有20顆玻璃珠的250 mL三角瓶中，裝液量為50 mL， 25℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)20 min，四層擦鏡紙過(guò)濾得到單細(xì)胞菌懸液。稀釋一定倍數(shù)，使其菌濃度在105～106CFU/mL之間。

將10 μL單細(xì)胞菌懸液均勻涂布在金屬載片的上表面，用鑷子將載片轉(zhuǎn)移至載物臺(tái)。ARTP誘變?cè)O(shè)置參數(shù)如下：功率100 W，氣流量10 L/min，照射時(shí)間依次為 0(對(duì)照)、5、10、15、20、25、30 s。處理后將載片轉(zhuǎn)移到裝有1 mL生理鹽水的EP管中，振蕩洗脫形成新的菌懸液，涂布平板后25℃培養(yǎng)3 d后對(duì)平板菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。致死率=(未經(jīng)誘變處理菌落數(shù)-經(jīng)誘變處理菌落數(shù))/未經(jīng)誘變菌落數(shù)×100%。每組3個(gè)平行。

將誘變處理后的菌液轉(zhuǎn)移到裝有1 mL生理鹽水的EP 管中，振蕩洗脫形成新的菌懸液，稀釋一定倍數(shù)，取100 μL菌濃度在105～106CFU/mL之間的菌液涂布于加入一定質(zhì)量濃度丙二酸、碘乙酸、丙二酸-碘乙酸混合的篩選平板后25℃培養(yǎng)3 d，挑選出生長(zhǎng)良好的單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后按照1.2.1所述進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并測(cè)定DHA產(chǎn)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 原始菌株的生長(zhǎng)特性

為確定裂殖壺菌SR21對(duì)數(shù)期時(shí)間，每6 h取4 mL培養(yǎng)液，8 000 r/min離心5 min洗滌獲得菌體，凍干至恒重。以生物量為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線如圖1 所示。

圖1 裂殖壺菌SR21生長(zhǎng)曲線

從圖1可以看出，菌體在培養(yǎng)12 h后進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段，48 h之后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期。

為確定最佳種齡，選擇對(duì)數(shù)期中后期幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的種子液接入搖瓶，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，并測(cè)定最終的生物量、油脂總量及DHA產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 種齡對(duì)裂殖壺菌SR21發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響

從表1可以看出，種齡為48 h時(shí)，生物量、油脂總量和DHA產(chǎn)量均最高。因此，在后續(xù)的研究中種子的培養(yǎng)時(shí)間確定為48 h。

以48 h為種齡，對(duì)原始菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，研究其細(xì)胞生長(zhǎng)、底物消耗及產(chǎn)物合成特性。每隔12 h采集 一次發(fā)酵液樣品，測(cè)定生物量、殘?zhí)且约癉HA產(chǎn)量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 殘?zhí)恰⑸锪考癉HA產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線

從圖2可以看出，葡萄糖在120 h時(shí)全部耗盡，此時(shí)的生物量和DHA產(chǎn)量分別達(dá)到30.48、4.51 g/L。以這一批次的搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)作為后續(xù)誘變和篩菌研究的對(duì)照批次，該批次油脂總量為19.36 g/L，并確定后續(xù)研究中的搖瓶培養(yǎng)周期為120 h。

2.2 ARTP誘變時(shí)間的確定

ARTP誘變是一種新型的誘變方式，目前廣泛地應(yīng)用于微生物誘變育種。程功等[9]利用ARTP選育L-高精氨酸和8-氮鳥嘌呤抗性菌株，該菌株的L-精 氨酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了49.79%。ARTP誘變處理時(shí)間不同，菌株的突變率也不一樣。在不同的誘變時(shí)間下，分析菌體的致死率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 ARTP不同誘變時(shí)間下菌體的致死率

從圖3可以看出，在0～15 s內(nèi)，隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率快速增加，15 s后隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)致死率增加緩慢。當(dāng)誘變時(shí)間達(dá)到30 s時(shí)，致死率達(dá)到100%。據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道，當(dāng)致死率處于85%～95%之間時(shí)，可獲得較高的正突變率。誘變時(shí)間為15 s時(shí)，致死率為88%，因此選用15 s作為后續(xù)誘變的處理時(shí)間。

2.3 篩選條件的確定

2.3.1 丙二酸篩選

丙二酸是琥珀酸脫氫酶抑制劑，能夠抑制三羧酸循環(huán)，造成檸檬酸的大量積累。所積累的檸檬酸能夠在檸檬酸裂解酶的作用下生成乙酰-CoA，為脂肪酸的合成提供更多前體物質(zhì)[11]。將誘變后菌株涂布在添加有不同質(zhì)量濃度丙二酸平板上，25℃條件下培養(yǎng)3 d，菌株的生長(zhǎng)情況如表2所示。

表2 誘變后菌株在不同丙二酸質(zhì)量濃度平板上的生長(zhǎng)情況

注：+.菌落個(gè)數(shù)在10～25之間；+/-.菌落個(gè)數(shù)在1～10之間；-.不生長(zhǎng)。下同。

從表2可以看出，當(dāng)丙二酸質(zhì)量濃度為1.4 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)完全被抑制，因此選取1.2 g/L作為篩選平板中丙二酸的添加質(zhì)量濃度。

2.3.2 碘乙酸篩選

碘乙酸能夠不可逆地抑制脂肪酸合成酶和磷酸甘油醛脫氫酶，從而抑制EMP途徑。經(jīng)過(guò)誘變的菌株，只有少數(shù)變異的細(xì)胞具有較強(qiáng)的 HMP，能夠在EMP途徑受到抑制后，依靠HMP途徑存活下來(lái)。因此，具有碘乙酸抗性的菌株有較強(qiáng)的HMP途徑，能夠提供更多的NADPH，促進(jìn)脂肪酸的合成，有益于DHA的積累[12]。將誘變后菌株涂布在添加有不同質(zhì)量濃度碘乙酸平板上，25℃條件下培養(yǎng)3 d，菌株的生長(zhǎng)情況如表3所示。

表3 誘變后菌株在不同碘乙酸質(zhì)量濃度平板上的生長(zhǎng)情況

從表3可以看出，當(dāng)?shù)庖宜豳|(zhì)量濃度為0.14 g/L 時(shí)，菌體生長(zhǎng)完全被抑制，因此選取篩選平板中碘乙酸的質(zhì)量濃度為0.12 g/L。

2.3.3 復(fù)合篩選

有研究表明，復(fù)合因子篩選平板根據(jù)雙重作用可以提高篩選效率[13]。對(duì)混合篩選平板中丙二酸和碘乙酸的質(zhì)量濃度進(jìn)行了研究，組合方式及裂殖壺菌SR21的生長(zhǎng)情況如表4所示。

從表4可以看出，在2號(hào)和4號(hào)平板中菌體致死率均較高，對(duì)2號(hào)篩選平板和4號(hào)篩選平板上的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)2號(hào)平板中的致死率略高于4號(hào)。因此，可以確定2號(hào)平板的組合為混合平板最佳的組合方式，即碘乙酸質(zhì)量濃度為0.06 g/L，丙二酸質(zhì)量濃度為0.4 g/L。

表4 誘變后菌株在不同質(zhì)量濃度丙二酸-碘乙酸復(fù)合篩選平板上的生長(zhǎng)情況

2.4 誘變選育

利用上述3種平板(1.2 g/L丙二酸篩選平板、0.12 g/L碘乙酸篩選平板和0.4 g/L丙二酸-0.06 g/L碘乙酸混合篩選平板)篩選后，共獲得27株突變株，其中利用丙二酸篩選得到的8株突變株依次命名為NA1～NA8，利用碘乙酸平板篩選獲得的8株突變株依次命名為NB1～NB8，利用丙二酸-碘乙酸混合平板篩選得到的11株突變株依次命名為NC1～NC11。測(cè)定所有誘變菌株經(jīng)120 h搖瓶發(fā)酵后的生物量、油脂總量及DHA產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 誘變菌株經(jīng)120 h搖瓶發(fā)酵后的生物量、

從圖4可以看出：NA1～NA8經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后生物量差異較小，DHA產(chǎn)量相對(duì)較高的3株為NA1、NA2和NA3(圖4(a))； NB1～NB8的生物量差異也較小，DHA產(chǎn)量相對(duì)較高的3株為NB4、NB5和NB8(圖4(b))；NC1～NC11的生物量存在較大差異，DHA產(chǎn)量相對(duì)較高的3株為NC3、NC4和NC6(圖4(c))。

本實(shí)驗(yàn)選取了每個(gè)篩選批次中DHA產(chǎn)量較高的3株菌，比較其發(fā)酵特性，結(jié)果如表5所示。

表5 不同篩選方法DHA產(chǎn)量比較

從表5可以看出，丙二酸抗性菌株、碘乙酸抗性菌株和丙二酸-碘乙酸復(fù)合抗性菌株的平均DHA產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比，分別提高了37.92%、14.41%、7.76%。單一篩選平板選育的菌株其生物量相對(duì)穩(wěn)定，且誘變的效果更好，其中丙二酸篩選法對(duì)提高DHA的產(chǎn)量有更為明顯的效果。最佳的混合篩選平板質(zhì)量濃度并不是丙二酸篩選質(zhì)量濃度與碘乙酸篩選質(zhì)量濃度的簡(jiǎn)單結(jié)合，這說(shuō)明復(fù)合篩選平板具有的雙重篩選能力具有更強(qiáng)的致死效應(yīng)，致死率過(guò)高，往往產(chǎn)生的負(fù)突變更多，這可能是復(fù)合篩選平板效果并不理想的原因。本實(shí)驗(yàn)最終確定以DHA產(chǎn)量最高的NA2作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

2.5 遺傳穩(wěn)定性

對(duì)菌株NA2進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)(即將平板上活化的菌落接種到另一個(gè)平板上進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程，轉(zhuǎn)接一次為一代，以此類推)，以4℃冰箱保存且生長(zhǎng)良好的第二代菌株為對(duì)照，連續(xù)傳代5次。對(duì)每一代菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，DHA產(chǎn)量如表6所示。

表6 NA2傳代5次的測(cè)定結(jié)果

從表6可以看出，DHA產(chǎn)量并沒(méi)有隨著傳代次數(shù)的增加而出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，因此可以證明突變株NA2具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

以裂殖壺菌SR21為出發(fā)菌株，經(jīng)ARTP誘變15 s，稀釋一定倍數(shù)，使其菌濃度在105～106CFU/mL之間，取100 μL涂布于1.2 g/L丙二酸篩選平板上，搖瓶發(fā)酵120 h后測(cè)定誘變株的生物量、油脂總量、DHA產(chǎn)量。最終獲得突變株NA2，其生物量、油脂總量、DHA產(chǎn)量達(dá)到36.00、22.24、6.59 g/L，與原始菌株相比分別提高18.11%、14.87%和46.12%。傳代5次后，NA2遺傳性狀穩(wěn)定。