史文艷 孫 震

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

亞硝酸鹽可促進肉制品發(fā)色、形成特有風(fēng)味、延長肉制品貨架期、抑制肉毒梭狀桿菌生長及毒素產(chǎn)生等優(yōu)勢[1-5]，只要符合GB 2760的規(guī)定限量，在肉制品加工中添加亞硝酸鹽是允許的。但亞硝酸鹽不僅對其他致病菌如蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的抑制作用微弱[6]，且存在潛在致癌風(fēng)險[7-8]，因此，研究開發(fā)出比亞硝酸鹽更安全的可用于肉制品的抑菌劑具有重要意義。

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽(ε-PLH)具有廣譜抑菌性，不僅可抑制革蘭氏陽性菌(G+)及真菌，而且對部分革蘭氏陰性菌(G-)也有強烈抑制作用。乳酸鏈球菌素(Nisin)對G+菌具有較強抑制作用，特別是對可生成芽孢的細菌，但對G-基本無抑制作用?，F(xiàn)有研究還未發(fā)現(xiàn)某種食品抑菌劑單獨使用就能有效抑制或殺死食品中所有微生物，抑菌劑復(fù)配使用不僅可降低單一抑菌劑使用量，而且還能增強抑制效果。本試驗旨在研究ε-PLH與Nisin的聯(lián)合抑菌作用及其機制，為ε-PLH和Nisin在低溫肉制品中的復(fù)合應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.2 材料與試劑

蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)：江南大學(xué)食品學(xué)院實驗室保存；

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、平板計數(shù)培養(yǎng)基：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

ε-PLH：92.87%，江蘇一鳴生物股份有限公司；

乳酸鏈球菌素(Nisin)：106IU/g，江蘇一鳴生物股份有限公司；

碘化丙啶PI染色液：50 μg/mL，含RNase，上海源葉生物科技有限公司；

堿性磷酸酶試劑盒、AKP試劑盒、ATP酶試劑盒、考馬斯亮藍試劑盒：南京建成生物工程研究所；

鹽酸：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

2,4-二硝基苯肼：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

DNP試劑：精確稱取594 mg 2,4-二硝基苯肼，溶于1 000 mL 2 mol/L HCl溶液中，搖勻完全溶解后，置于棕色瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 儀器與設(shè)備

電子天平：FA2204B型，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋：SYQ-DSX-280B型，上海申安醫(yī)療器械廠；

新世紀紫外可見光光光度計：T6型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GNP-9270型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

超凈工作臺：ZHJH-C1209C型，上海智城分析儀器制造有限公司；

高速冷凍離心機：CR21GⅢ型，日本日立公司；

流式細胞儀：FACSCalibur型，美國BD公司；

電泳儀：1645050型，美國伯樂公司；

化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：ChemiDoc XRS+型，美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 蠟狀芽孢桿菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，臨用時用無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋至所需菌濃度。

1.2.2ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌最小抑菌濃度(MIC)的測定 以蠟狀芽孢桿菌為研究對象，采用試管二倍稀釋法。以最后1根澄清試管內(nèi)防腐劑的濃度計為能抑制蠟狀芽孢桿菌生長的最低濃度。同時測定600 nm 處菌懸液的吸光值，得到關(guān)于ε-PLH和Nisin劑量和抑菌率的關(guān)系。按式(1)計算抑菌率。

(1)

式中：

I——抑菌率，%；

A1——陽性對照組的吸光值；

A0——陰性對照組的吸光值；

A——試驗組的吸光值。

1.2.3ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌聯(lián)合作用效果的測定 采用棋盤法，用試管代替96孔板。37 ℃培養(yǎng)18 h后肉眼觀察結(jié)果，分光光度計測定600 nm處的吸光值，按式(2)計算分級抑菌濃度指數(shù)FICI，并判斷相互作用類型。

FICI=MIC(A聯(lián)合)/MIC(A單獨使用)+MIC(B聯(lián)合)/MIC(B單獨使用)，

(2)

式中：

FICI——分級抑菌濃度指數(shù)；

MIC(A聯(lián)合)、MIC(B聯(lián)合)——分別表示聯(lián)合使用時Nisin和ε-PLH的最小抑菌濃度，mg/L；

MIC(A單獨使用)、MIC(B單獨使用)——分別表示Nisin和ε-PLH單獨使用時的最小抑菌濃度，mg/L。

FICI<0.5，協(xié)同作用；0.52，拮抗作用。

1.2.4 樣品的處理 蠟狀芽孢桿菌的菌懸液稀釋至106CFU/mL，加入ε-PLH與Nisin溶液，使菌懸液中抑菌劑的終濃度分別為1/4 MICε-PLH，1/4 MIC Nisin，1/8 MICε-PLH+1/8 MIC Nisin，以等量無菌PBS替代防腐劑作為空白對照。

1.2.5ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌蠟狀芽孢桿菌菌體活力的影響 根據(jù)文獻[9]修改如下：樣品經(jīng)37 ℃培養(yǎng)4 h 后取出，加入PI染色液，避光作用15 min，流式細胞儀分析。

1.2.6ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌細胞壁完整性的影響 根據(jù)文獻[10]修改如下：樣品經(jīng)37 ℃培養(yǎng)3 h后取1 mL菌液，4 ℃下3 500 r/min離心10 min。取100 μL上清，依次測定樣品的AKP的活性。

1.2.7 ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌ATPase活力的影響 根據(jù)文獻[11]修改如下：樣品于5 000 r/min下離心5 min后棄去上清液，無菌生理鹽水洗滌菌體并重懸；經(jīng)超聲波破碎后，12 000 r/min冷凍離心20 min，所得上清液備用。用ATP酶試劑盒進行測定。

1.2.8ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌代謝過程中丙酮酸含量的影響 根據(jù)文獻[12]，采用DNP法對蠟狀芽孢桿菌代謝過程中丙酮酸含量進行測定。所得丙酮酸含量的標準曲線方程為：y=0.040 1x+0.005 7，R2=0.999 6。

1.2.9ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌紫外吸收物的影響

根據(jù)文獻[13]的試驗方法，修改如下：菌懸液3 500 r/min 離心5 min，無菌PBS洗滌2次。37 ℃培養(yǎng)，于0，1，3，5，7，9，12 h取樣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，測定260 nm處的吸光值。

1.2.10ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌菌體蛋白的影響

根據(jù)文獻[14]的試驗方法，修改如下：37 ℃培養(yǎng)3，6 h 后取樣。3 500 r/min 離心10 min，取菌體沉淀，經(jīng)PBS洗滌2次后用定量無菌水溶解，4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，取上清液100 μL，加入25 μL上樣緩沖液，沸水浴5 min，上樣操作，進行SDS-PAGE電泳。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Origin 9.0進行數(shù)據(jù)處理和分析，SPSS軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌MIC的影響

通過肉眼觀察，得到ε-PLH、Nisin作用于蠟狀芽孢桿菌的MIC分別為12.5，6.25 mg/L。結(jié)合ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌作用的抑菌率(見表1)可看出，隨著ε-PLH、Nisin濃度的升高，抑菌率也逐漸增大，當ε-PLH、Nisin分別為12.5，100 mg/L時，可完全抑制蠟狀芽孢桿菌的生長。由此說明，通過僅肉眼觀察會造成很大的誤差，影響結(jié)果的準確性。

2.2 ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌聯(lián)合作用效果

ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌聯(lián)合作用效果見表2。

由表2可計算出，F(xiàn)ICI=0.25，F(xiàn)ICI<0.5，故ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌具有協(xié)同抑制作用。

表1 ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌作用的抑菌率

表2 ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌聯(lián)合作用效果

? “-”表示無菌落生長；“+”表示有菌落生長。

2.3 ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌細胞壁完整性的影響

細胞壁具有保護細胞抵抗外界不利因素、固定細胞外形、保證細胞完整性等功能。堿性磷酸酶通常位于細菌細胞壁與細胞膜之間，只有在細胞壁出現(xiàn)破損時，AKP才會從壁膜之間泄露出去。通過測定堿性磷酸酶的活性強弱，可判斷出菌體細胞壁被破壞的程度。

由表3可知，與對照組相比，經(jīng)ε-PLH、Nisin處理過的蠟狀芽孢桿菌菌懸液中AKP含量均有所升高，尤其是ε-PLH、Nisin聯(lián)合作用時AKP活力最高，說明細胞壁結(jié)構(gòu)被破壞程度大，細胞壁通透性增加，推測可能會影響蠟狀芽孢桿菌的生長和代謝活動。

ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌細胞膜的破壞作用與Chen等[15]所研究的大分子聚合抑菌劑對G+和G-細菌膜結(jié)構(gòu)的破壞作用機制類似。其研究表明，由于細菌帶負電，抑菌劑具有高的正電荷密度，靜電相互作用很快使它們彼此接觸。當亞硝酸鹽細菌處于懸浮液中時，抑菌劑從細菌中置換表面二價離子如鈣和鎂，并與帶負電荷的磷脂膜結(jié)合，迅速中和甚至逆轉(zhuǎn)細菌的表面電荷，從而引起膜滲透性的輕微變化。該階段，抑菌劑與細菌的相互作用是可逆的，當抑菌劑濃度更高時，相對高的濃度可使膜蛋白變性并開始滲透磷脂雙層，膜滲透性的增加導(dǎo)致鉀離子泄漏，使膜結(jié)構(gòu)進一步不穩(wěn)定。最終，高濃度的殺菌劑導(dǎo)致細菌膜完全崩解，起到殺菌作用。

表3ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌的AKP含量的影響?

Table3Effectofε-polylysinehydrochlorideandNisinonAKPcontentofBacilluscereus(n=3)

組別AKP活力/(King Unit·g-1·Prot)空白對照0.78±0.02a1/4 MIC ε-PLH0.93±0.03c1/4 MIC Nisin1.09±0.03b1/8 MIC ε-PLH+1/8 MIC Nisin1.45±0.04d

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌菌體活力的影響

碘化丙啶(PI)能夠透過死亡細胞或破損的細胞膜而對DNA進行染色，不能透過活細胞膜，故常用于鑒定死細胞。通過流式細胞儀檢測細胞數(shù)量和熒光強度的變化，可直觀得出菌體的存活率和損傷情況[16-17]。

由圖1可看出，與空白對照相比，經(jīng)ε-PLH、Nisin作用后的蠟狀芽孢桿菌的熒光強度明顯增大，表明細胞壁膜結(jié)構(gòu)均遭到破壞，細胞膜通透性增大。ε-PLH、Nisin聯(lián)合作用時熒光強度最大，菌體被破壞的程度最大，菌體活力最低，表明ε-PLH、Nisin 對蠟狀芽孢桿菌具有協(xié)同抑制作用。

圖1 ε-PLH、Nisin作用蠟狀芽孢桿菌經(jīng)PI染色后的

Figure 1 Flow cytometry analysis of ε-polylysine hydrochloride and Nisin acting on Bacillus cereus by PI staining

2.5 ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌ATPase活力的影響

ATPase存在于組織細胞及細胞器的膜上，在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要作用。通過檢測ATPase的含量，可以間接地反映出ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌能量代謝過程的影響。

由表4可看出，經(jīng)過ε-PLH、Nisin處理過的蠟狀芽孢桿菌Na+K+-ATPase活力顯著下降，說明能量代謝過程受阻，經(jīng)ε-PLH、Nisin聯(lián)合處理的蠟狀芽孢桿菌ATPase活力最低，結(jié)合對細胞壁的完整性的影響，推測可能是Nisin主要作用于破壞細胞膜結(jié)構(gòu)而增加細胞壁膜的通透性，使ε-PLH更容易作用于蠟狀芽孢桿菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致菌體代謝活動受阻，影響蠟狀芽孢桿菌的生長和代謝活動。

表4ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌Na+K+-ATPase活力的影響?

Table4Effectofε-polylysinehydrochlorideandNisinontheactivityofBacilluscereusNa+K+-ATPase(n=3)

組別Na+K+-ATPase活力/(U·mg-1·Prot)空白對照24.62±0.25a1/4 MIC ε-PLH11.82±0.30c1/4 MIC Nisin15.32±0.38b1/8 MIC ε-PLH+1/8 MIC Nisin10.28±0.19d

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.6 ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌代謝過程中丙酮酸含量的影響

丙酮酸是機體代謝的中間產(chǎn)物，處于糖酵解途徑的末端，同時它又連接著EMP途徑和TCA循環(huán)。作為能量代謝的中間產(chǎn)物，丙酮酸含量的多少可間接反映代謝活動的進程。

由圖2可看出，蠟狀芽孢桿菌代謝過程中丙酮酸含量經(jīng)歷了升高、下降再升高的過程。與對照組相比，經(jīng)過1/4 MICε-PLH、1/4 MIC Nisin單獨處理過的蠟狀芽孢桿菌菌懸液中，丙酮酸含量變化不大；但經(jīng)過1/8 MICε-PLH 與1/8 MIC Nisin聯(lián)合處理過的蠟狀芽孢桿菌菌懸液中，丙酮酸含量顯著下降，說明二者聯(lián)合作用影響甚至阻礙了蠟狀芽孢桿菌的能量代謝過程。

圖2 ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌代謝過程中丙酮酸

Figure 2 Effect ofε-polylysine hydrochloride and Nisin on pyruvate content in the metabolism ofBacilluscereus

2.7 ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌紫外吸收物的影響

核苷酸類物質(zhì)在260 nm處有強吸收，如果細菌膜受損，可通過檢測260 nm處的吸光度而估計出從細胞質(zhì)釋放的DNA和RNA的量，從而評定細胞膜的完整性。

由圖3可看出，對照組基本無紫外吸收，而經(jīng)ε-PLH、Nisin處理后的蠟狀芽孢桿菌菌懸液的紫外吸收均有所增加，說明蠟狀芽孢桿菌的細胞膜結(jié)構(gòu)受到了不同程度的破壞，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物的滲漏，從而進一步影響菌體代謝和生長。經(jīng)ε-PLH、Nisin聯(lián)合處理后，菌懸液紫外吸收值最大，說明聯(lián)合使用后菌體細胞膜破損程度最高，與AKP結(jié)果相對應(yīng)。從而進一步證明了ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌具有協(xié)同抑制作用，其中Nisin對蠟狀芽孢桿菌的細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞程度要強于ε-PLH，說明二者聯(lián)合使用時Nisin主要作用是破壞膜結(jié)構(gòu)，而ε-PLH則是影響代謝活動。

圖3 ε-PLH、Nisin對蠟狀芽孢桿菌紫外吸收物

Figure 3 Effect ofε-polylysine hydrochloride and Nisin on the content of UV absorption ofBacilluscereus

2.8 ε-PLH與Nisin對蠟狀芽孢桿菌菌體蛋白的影響

對菌體總蛋白的SDS-PAGE分析可證明抑菌劑能否影響和阻礙細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達。

與對照組相比，經(jīng)ε-PLH處理過的蠟狀芽孢桿菌菌體蛋白質(zhì)(2，4，6，8泳道)中，小分子蛋白質(zhì)尤其是<10 kDa分子量的蛋白質(zhì)明顯增多，說明ε-PLH可能影響了蛋白質(zhì)的合成和分解過程，可將大分子蛋白質(zhì)分解成小分子蛋白質(zhì)。經(jīng)1/4 MIC Nisin處理后，電泳條帶無明顯變化；經(jīng)1/8 MICε-PLH+1/8 MIC Nisin處理后，大分子量蛋白質(zhì)條帶顏色變淺，小分子蛋白質(zhì)增多且顏色加深，說明二者聯(lián)合作用對菌體的蛋白質(zhì)表達和正常代謝有一定抑制作用，且這種作用隨著培養(yǎng)時間的延長而增強。

3 結(jié)論

ε-PLH、Nisin抑制蠟狀芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為12.5，6.25 mg/L，并且二者具有協(xié)同抑制作用。協(xié)同抑菌機理為：Nisin首先破壞細胞壁胞膜，當菌體的細胞膜受損后，半透性喪失、流動性減弱、細胞的內(nèi)容物外泄。隨后ε-PLH進入細胞胞內(nèi)，抑制了細胞膜上的ATP酶活力、影響蛋白的合成和表達、導(dǎo)致細胞內(nèi)多種代謝途徑受阻，同時影響細胞膜的穩(wěn)定性和多種酶的反應(yīng)活性，達到協(xié)同抑菌的效果。后續(xù)研究可考慮在DNA分子水平或結(jié)合蛋白組學(xué)進一步探究ε-PLH、Nisin的協(xié)同抑菌機制。

1～4分別為對照組，經(jīng)過1/4 MIC ε-PLH，1/4 MIC Nisin以及1/8 MIC ε-PLH+1/8 MIC Nisin處理3 h后的電泳條帶；5～8分別為對照組，經(jīng)過1/4 MIC ε-PLH，1/4 MIC Nisin以及1/8 MIC ε-PLH+1/8 MIC Nisin處理6 h后的電泳條帶。

圖4 ε-PLH、Nisin作用下蠟狀芽孢桿菌菌體蛋白的SDS-PAGE電泳

Figure 4 SDS-PAGE electrophoresis ofBacilluscereusbacterial protein under the action of ε-polylysine hydrochloride and Nisin