肖 嵐李 誠程小平杜 昕

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2. 四川旅游學(xué)院食品學(xué)院，四川 成都 610100； 3. 四川高金實業(yè)集團(tuán)有限公司，四川 遂寧 629000)

牦牛是中國青藏高原的特殊家畜，經(jīng)過世代的自然選擇，牦牛顯示出對低氧環(huán)境極好的適應(yīng)性，這可能與牦牛血液的特殊性有一定關(guān)系[1-3]。本課題組[4]前期采用枯草芽孢桿菌(SICC1.197)聯(lián)合堿性蛋白酶制備出牦牛血低聚肽，利用超濾離心得到分子量<1 kDa的牦牛血低聚肽，并對其體外(還原力、ABTS+·清除力、·OH清除能力、DPPH·清除能力、總抗氧化力以及脂質(zhì)過氧化抑制能力)和小鼠體內(nèi)(丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、總抗氧化能力)的抗氧化能力進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)牦牛血低聚肽具有良好的抗氧化能力。姚星辰等[5]報道牦?；钚缘鞍拙哂酗@著的延長小鼠抗缺氧時間的作用。牦牛血是否與抗缺氧功能有一定的關(guān)聯(lián)尚未見相關(guān)報道。為了解具有抗氧化活性的牦牛血低聚肽是否具有抗缺氧活性，課題組采用高、中、低劑量牦牛血低聚肽對小鼠進(jìn)行了預(yù)試驗，常壓耐缺氧試驗結(jié)果顯示牦牛血低聚肽對小鼠缺氧耐受力有提高作用并呈劑量依賴性；亞硝酸鈉中毒存活試驗顯示，牦牛血低聚肽能延長缺氧小鼠的生存時間。因此，為了進(jìn)一步證實牦牛血低聚肽的抗缺氧活性并了解其作用機制，本試驗擬體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞建立缺氧損傷模型，探討牦牛血低聚肽對心肌細(xì)胞缺氧損傷的抑制作用及機制，旨在為進(jìn)一步研究牦牛血低聚肽對抗缺氧作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛血低聚肽：氨基酸含量85.25 g/100 g，平均分子量<1 kDa，實驗室自制；

DMEM培養(yǎng)基、血清：美國Thermo Fisher Scientific公司；

CCK8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、Caspase 3/9活性檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術(shù)公司；

細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；

蛋白marker：北京全式金生物技術(shù)有限公司；

乳酸脫氫酶(LDH)測試試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC，ABTS法)測試試劑盒：南京建成生物工程研究所；

大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒：武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

三氣培養(yǎng)箱：HF-100型，上海力申科學(xué)儀器有限公司；

倒置顯微鏡：IX51型，奧林巴斯(中國)有限公司；

CO2恒溫培養(yǎng)箱：MCO-15AC型，三洋電機(中國)有限公司；

全自動酶標(biāo)儀：Multiskan MK3型，美國Thermo Scientific公司；

流式細(xì)胞儀：CytoFLEX型，美國貝克曼庫爾特有限公司；

實時熒光定量PCR儀：QuantStudio 6型，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司。

1.3 細(xì)胞株與分組

H9c2心肌細(xì)胞株：生工生物工程(上海)股份有限公司。

H9c2細(xì)胞(DMEM+10% FBS+1%雙抗)復(fù)蘇與培養(yǎng)融合至80%～90%后，進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗以及濃度預(yù)試驗，在此基礎(chǔ)上確定牦牛血低聚肽的用量。將H9c2細(xì)胞分組：正常對照組、缺氧組、牦牛血低聚肽低劑量組(0.05 mg/mL)、牦牛血低聚肽中劑量組(0.4 mg/mL)、牦牛血低聚肽高劑量組(3.2 mg/mL)。

1.4 試驗方法

1.4.1 細(xì)胞缺氧模型的建立 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后，用培養(yǎng)基(含10% FBS+1%雙抗)調(diào)整細(xì)胞密度到5×104個/mL，接入96孔板，每組6個復(fù)孔，每孔100 μL細(xì)胞懸液，并設(shè)置空白孔，在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μL無菌PBS，37 ℃ 5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞融合至70%～80%后進(jìn)行分組處理并藥物干預(yù)。正常對照組常氧條件培養(yǎng)，加藥組加藥預(yù)處理4 h后換為缺氧培養(yǎng)基含(2% FBS)并置于三氣培養(yǎng)箱缺氧培養(yǎng)48 h。

1.4.2 指標(biāo)測定

(1) CCK-8法測定細(xì)胞存活率：按照1.4.1處理細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培養(yǎng)4 h，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定各孔吸光值OD450。

(2) 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：按照1.4.1處理細(xì)胞，按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明進(jìn)行，流式細(xì)胞儀上機檢測。

(3) 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中T-AOC含量、TNF-α含量、乳酸脫氫酶(LDH)活性的測定：按照1.4.1處理細(xì)胞，按照測試試劑盒說明書的要求檢測T-AOC含量、TNF-α含量、LDH活性。

(4) Western Blot檢測細(xì)胞中p-Akt、Akt、Survivin蛋白表達(dá)：按分組要求處理細(xì)胞后，提取單層貼壁細(xì)胞總蛋白并對蛋白進(jìn)行定量，蛋白變性，電泳分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(PVDF)膜上，采用ECL顯色系統(tǒng)進(jìn)行免疫印跡顯色，沖洗膠片，晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

(5) 細(xì)胞中Caspase-3與Caspase-9活性：按照1.4.1處理細(xì)胞，按照試劑盒說明書的要求進(jìn)行檢測。

(6) Western Blot法測定線粒體和細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的含量：按照1.4.1處理細(xì)胞，參考1.4.2(4)采用Western Blot法測定。

(7) QPCR檢測細(xì)胞中P13K、AKt、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α基因表達(dá)：按照1.4.1處理細(xì)胞，實時熒光定量PCR檢測mRNA。

(8) 細(xì)胞線粒體膜電位的檢測：按照1.4.1處理細(xì)胞后，按照線粒體膜電位檢測試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示有顯著性差異。統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0等軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細(xì)胞存活率和LDH釋放量的影響

如圖1(a)所示，與正常組相比，持續(xù)缺氧48 h導(dǎo)致H9c2細(xì)胞存活率均出現(xiàn)了一定程度的下降，差異極顯著(P<0.01)，表明H9c2細(xì)胞缺氧損傷明顯。采用高、中、低劑量的牦牛血低聚肽干預(yù)缺氧細(xì)胞，能提高缺氧細(xì)胞的存活率；與缺氧組比較，高、中劑量組對細(xì)胞凋亡的抑制作用極顯著(P<0.01)。此結(jié)果提示，牦牛血低聚肽具有改善缺氧H9c2細(xì)胞存活率的作用，且存在劑量依賴性。

正常情況下，LDH主要分布在心肌細(xì)胞胞質(zhì)中，是不能透過細(xì)胞膜進(jìn)入膜外空間(如細(xì)胞培養(yǎng)液上清液)[6]，只有當(dāng)細(xì)胞損傷后，LDH才會釋放進(jìn)入細(xì)胞上清液中使其活性升高，因此，通過測定細(xì)胞上清液中LDH的活性可間接反映細(xì)胞的損傷程度。由圖1(b)可知，缺氧導(dǎo)致H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中LDH的活性極顯著升高(P<0.01)，而牦牛血低聚肽預(yù)處理則可降低培養(yǎng)液上清液中LDH含量且存在劑量依賴性，其中高、中劑量組可極顯著降低LDH活性(P<0.01)。此結(jié)果提示，牦牛血低聚肽對缺氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜顯示出良好的保護(hù)作用，且存在劑量依賴性。

與正常對照組相比，# P<0.05，## P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01

2.2 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細(xì)胞凋亡的影響

圖2(a)顯示，正常對照組H9c2細(xì)胞凋亡不明顯(凋亡率<5%)；圖2(b)顯示，缺氧組H9c2細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，凋亡率<10%，表明缺氧可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡；圖2(c)～(e)顯示牦牛血低聚肽3個劑量組均能減少缺氧介導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡，且中、高劑量組具有極顯著效果(P<0.01)。這與2.1的試驗結(jié)果相對應(yīng)，再次提示牦牛血低聚肽對缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用。

2.3 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體是細(xì)胞呼吸的主要場所，缺氧會誘導(dǎo)線粒體結(jié)構(gòu)和動力學(xué)上的改變，包括線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，MMP)的坍塌、線粒體膜孔道的開放，從而影響膜內(nèi)信號物質(zhì)(如細(xì)胞色素C)的釋放等[7]，引起線粒體代謝紊亂，導(dǎo)致線粒體功能損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致線粒體膜瓦解，釋放Caspase蛋白[8]，激活下游的凋亡通路[9]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。因此，線粒體膜電位在凋亡起始過程對防治缺氧相關(guān)疾病的發(fā)生非常重要。

本試驗觀察到持續(xù)缺氧處理H9c2細(xì)胞48 h，其MMP出現(xiàn)極顯著下降(P<0.01)，而牦牛血低聚肽干預(yù)組則可抑制缺氧導(dǎo)致的MMP下降，中劑量組有顯著效果(P<0.05)，而高劑量組的效果極顯著(P<0.01)(圖3)。結(jié)果提示，牦牛血低聚肽可能通過維持缺氧條件下細(xì)胞MMP的穩(wěn)定進(jìn)而減少細(xì)胞損傷。

2.4 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細(xì)胞線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放的影響

線粒體損傷是誘發(fā)細(xì)胞調(diào)亡的主要原因之一[11]。2.3 的研究結(jié)果提示牦牛血低聚肽可顯著地提高細(xì)胞在缺氧條件下的線粒體膜電位，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)的完整。故本試驗采用Western Blot法測定線粒體和細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的含量，線粒體細(xì)胞色素C含量與細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的含量的比值常被用作反映線粒體結(jié)構(gòu)損傷程度的指標(biāo)[12]，結(jié)果見圖4。缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體中大量的釋放，而細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞色素C含量顯著增加，表現(xiàn)為線粒體中細(xì)胞色素C含量與細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的含量的比值極顯著下降(P<0.01)，僅為正常對照組的50%；然而，牦牛血低聚肽預(yù)處理則可抑制缺氧H9c2細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素C的釋放(P<0.01)且呈劑量依賴性，進(jìn)一步提示牦牛血低聚肽對缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與維持細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)完整性、減少其細(xì)胞色素C釋放有關(guān)。

與正常對照組相比，# P<0.05，## P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01

2.5 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細(xì)胞中p-Akt、Akt、Survivin蛋白表達(dá)的影響

PI3K-Akt信號通路是一條重要的抗凋亡/促增殖信號途徑[13]，文獻(xiàn)[14]證實激活PI3K-Akt信號通路在抗凋亡過程中起關(guān)鍵作用。激活PI3K-Akt通路促進(jìn)Akt在Ser473位點磷酸化后形成P-Akt，有利于對多下游多個靶點的調(diào)控，比如調(diào)控凋亡蛋白Caspase家族促進(jìn)抗凋亡機制的活化，增加細(xì)胞存活[15]。如圖5所示，與正常對照組比較，持續(xù)缺氧導(dǎo)致H9c2細(xì)胞中p-Akt蛋白顯著過表達(dá)(P<0.01)；牦牛血低聚肽進(jìn)一步促進(jìn)了缺氧細(xì)胞中的p-Akt蛋白過表達(dá)且呈劑量依賴性，其中高、中劑量組過表達(dá)最明顯(P<0.01)。持續(xù)缺氧也導(dǎo)致細(xì)胞中Akt蛋白過表達(dá)，但牦牛血低聚肽對缺氧細(xì)胞中AKt蛋白表達(dá)水平無顯著影響(P>0.05)。計算p-Akt/Akt的比值，與正常組相比，缺氧組p-Akt/Akt的比值為正常對照組的5.55%，明顯降低(P<0.01)；與缺氧組相比，牦牛血低聚肽各劑量均能增加p-Akt/Akt的水平，分別為正常對照組的7.6%，35.7%，38.6%，高、中劑量組增加最為明顯(P<0.01)。結(jié)果提示，牦牛血低聚肽對缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能與PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

存活素蛋白(Survivin)具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的雙重功能[16-17]。與正常對照組比較，缺氧誘導(dǎo)Survivin蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.01)；而牦牛血低聚肽干預(yù)缺氧H9c2細(xì)胞可劑量依耐性地促進(jìn)Survivin蛋白表達(dá)水平提高，其中高、中劑量組增加最明顯(P<0.01)。

與正常對照組相比，# P<0.05，## P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01

圖3 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Figure 3 Effect of yak blood oligopeptide on mitochondrial membrane potential of hypoxia H9c2 cells (n=6)

與正常對照組相比，## P<0.01；與缺氧組相比，** P<0.01

Figure 4 Effect of yak blood oligopeptide on cytochrome C release from mitochondria of hypoxia-induced H9c2 cells (n=6)

2.6 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細(xì)胞中Caspase-3與Caspase-9表達(dá)的影響

調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白分布在線粒體外膜上[12]，主要包括抑制細(xì)胞凋亡的蛋白[18]和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，具有維持或破壞線粒體膜完整性的作用[19]。正常情況下，這兩類蛋白的表達(dá)量處于相對平衡的狀態(tài)，當(dāng)缺氧介導(dǎo)細(xì)胞時，促凋亡蛋白會過表達(dá)而破壞線粒體，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡發(fā)生[20]，而當(dāng)抑制細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)量較高時，可抑制細(xì)胞調(diào)亡。如圖6所示，與正常對照組比較，持續(xù)缺氧導(dǎo)致H9c2細(xì)胞中凋亡蛋白Caspase-3[圖6(a)]以及Caspase-9[圖6(b)]極顯著過表達(dá)(P<0.01)；而牦牛血低聚肽干預(yù)則可劑量依賴性地下調(diào)這2個凋亡蛋白的表達(dá)，其中高、中劑量組減少最明顯(P<0.01)。此結(jié)果提示，抑制缺氧條件下凋亡蛋白Caspase-3/-9蛋白的表達(dá)有可能是牦牛血低聚肽發(fā)揮細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)作用的機制之一。

與正常對照組相比，# P<0.05，## P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01

圖5 牦牛血低聚肽對缺氧條件下H9c2細(xì)胞中p-Akt、Akt、Survivin蛋白表達(dá)的影響

Figure 5 Effect of yak blood oligopeptide on expression of p-Akt, Akt and Survivin proteins in hypoxia-induced H9c2 cells (n=6)

與正常對照組相比，## P<0.01；與缺氧組相比，** P<0.01

Figure 6 Effect of yak blood oligopeptide on expression of Caspase-3 and Caspase-9 proteins in hypoxi-ainduced H9c2 cells (n=6)

2.7 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細(xì)胞中P13K、AKt、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α基因表達(dá)的影響

本試驗檢測了5個與缺氧細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，結(jié)果見表1。持續(xù)缺氧導(dǎo)致H9c2細(xì)胞中的Caspase-3/-9的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；而牦牛血低聚肽預(yù)處理組則可下調(diào)這2個凋亡基因的表達(dá)，其中高劑量組減少最明顯(P<0.01)；Caspase-3/-9的mRNA表達(dá)水平的變化趨勢與2.5測定的蛋白結(jié)果對應(yīng)。結(jié)果提示，牦牛血低聚肽可通過抑制凋亡蛋白及其mRNA的表達(dá)從而發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞H9c2的作用。

與正常對照組相比，缺氧導(dǎo)致H9c2細(xì)胞中P13K的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，而AKt的mRNA表達(dá)水平降低，但無顯著差異(P>0.05)；牦牛血低聚肽各劑量均能促進(jìn)缺氧細(xì)胞P13K的mRNA表達(dá)水平的增加，其中高劑量組增加最明顯(P<0.01)，而對缺氧細(xì)胞中AKt的mRNA表達(dá)水平無顯著影響(P>0.05)；PI3K-Akt信號通路的mRNA表達(dá)水平的變化趨勢與2.5測定的蛋白結(jié)果對應(yīng)。

低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)是機體調(diào)控低氧反應(yīng)基因的核心轉(zhuǎn)錄因子[21]，HIF-1α的mRNA表達(dá)水平升高可啟動對多個下游低氧反應(yīng)基因的調(diào)控[22]，介導(dǎo)與缺氧有關(guān)的各種生理反應(yīng)[23]，有利于細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境[24]。由表1可知，心肌細(xì)胞持續(xù)缺氧48 h誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞中HIF-1α的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，原因是缺氧抑制了PHD(脯氨酰羥化酶)活性導(dǎo)致HIF-1α的脯氨酰殘基羥化受到抑制，進(jìn)而抑制HIF-1α與腫瘤抑制蛋白VHL結(jié)合，使HIF-1α的mRNA表達(dá)呈指數(shù)方式增長[25]。本研究結(jié)果顯示，牦牛血低聚肽干預(yù)缺氧細(xì)胞能劑量依耐性地增加HIF-1α的mRNA表達(dá)水平，其中高、中劑量組增加最明顯(P<0.01)。結(jié)果提示，牦牛血低聚肽可通過誘導(dǎo)HIF-1α的mRNA表達(dá)水平升高進(jìn)而提高細(xì)胞低氧適應(yīng)性。

表1 牦牛血低聚肽對缺氧條件下H9c2細(xì)胞中P13K、AKt、Caspase-3、Caspase-9以及HIF-1α基因表達(dá)的影響?

? 與正常對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01。

2.8 牦牛血低聚肽對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中T-AOC、TNF-α的影響

缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞能量代謝紊亂、氧自由基增多，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，引起細(xì)胞凋亡[26]，因此，總抗氧化能力(T-AOC，ABTS法)的強弱直接影響心肌細(xì)胞的存活狀態(tài)，反映心肌細(xì)胞受損傷的程度。如表2所示，與對照組比較，缺氧組上清液的T-AOC極顯著降低(P<0.01)，而牦牛血低聚肽可提高心肌細(xì)胞上清液的T-AOC且顯現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性(P<0.01)，提示牦牛血低聚肽可減少細(xì)胞氧自由基、減少胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生[27]，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

由細(xì)胞外信號導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡稱為死亡受體途徑[28]，又稱外源性凋亡途徑。TNFR-Ⅰ和TNFR-Ⅱ是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族中的2個受體亞型[29]，可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]。TNFR-Ⅰ經(jīng)過三聚體化后可激活Caspase途徑進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；TNFR-Ⅱ的激活可抑制NFκB的活性進(jìn)而減少炎癥因子TNF-α的釋放，減少細(xì)胞凋亡[31]。本試驗結(jié)果顯示，缺氧組H9c2細(xì)胞上清液中TNF-α含量極顯著增高(P<0.01)；牦牛血低聚肽3個劑量組均能劑量依耐性地降低缺氧H9c2細(xì)胞上清液中TNF-α含量，其中高劑量組效果最明顯(P<0.01)。結(jié)果提示，牦牛血低聚肽可通過死亡受體途徑減少TNF-α含量而發(fā)揮對心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用。>

表2牦牛血低聚肽對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中T-AOC、TNF-α的影響?

Table2EffectofyakbloodoligopeptideonT-AOCandTNF-alphaincellculturesupernatant

分組TNF-α/(pg·mL-1)T-AOC/(U·mL-1)正常對照組58.242±11.003 0.720±0.031 缺氧組 235.002±17.050##0.150±0.011##低劑量組 191.024±11.855##??0.180±0.008##?中劑量組 121.189±10.290##??0.504±0.016##??高劑量組 82.958±8.967#??0.571±0.016##??

? 與正常對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01。

3 結(jié)論

牦牛血低聚肽能夠劑量依賴性地提高缺氧(37 ℃，5% O2)條件下大鼠H9c2心肌細(xì)胞的存活率、降低其凋亡率以及LDH的釋放，表現(xiàn)出良好的缺氧細(xì)胞損傷防護(hù)功效。牦牛血低聚肽對缺氧H9c2大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其清除細(xì)胞氧自由基、抗細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化；抑制線粒體膜電位降低、抑制線粒體中細(xì)胞色素C的釋放、增加細(xì)胞中抗凋亡蛋白(Survivin)的表達(dá)、抑制凋亡蛋白(Caspase-3、Caspase-9)的表達(dá)、介導(dǎo)PI3K-Akt信號通路以及影響編碼上述蛋白的mRNA水平有關(guān)。在牦牛血低聚肽作用下抗缺氧相關(guān)蛋白之間的關(guān)聯(lián)和變化關(guān)系有待于在分子水平進(jìn)一步研究。