張曉旭劉紅芹周錫欽嚴(yán) 江徐寶財(cái)

(1. 北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048；2. 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室﹝北京工商大學(xué)﹞， 北京 100048；3. 食品添加劑與配料北京工程研究中心﹝北京工商大學(xué)﹞，北京 100048； 4. 北京味食源食品科技有限責(zé)任公司，北京 101200)

辣椒(CapsicumfrutescenceL.)又稱番椒、秦椒，屬茄科辣椒屬植物[1]。辣椒含有多種有效成分，其中辣味成分主要為辣椒堿。它是一種含有酚羥基的生物堿，室溫條件下為白色晶體，可溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑中[2]。高純度的辣椒堿具有消炎[3]、抑菌[4]、鎮(zhèn)痛[5]、殺蟲(chóng)[6]等功效，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。目前，辣椒堿的提取方法主要有：水浴浸提法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法以及超臨界CO2提取法[7-9]。但目前有關(guān)辣椒堿的微波、超聲輔助提取法還不能將其規(guī)?；?yīng)用到實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中。超臨界 CO2萃取工藝也存在技術(shù)條件設(shè)計(jì)困難、前期投資成本和運(yùn)營(yíng)成本高等不足之處[10]。浸出法是目前應(yīng)用廣泛且比較成熟的技術(shù)，也是目前國(guó)際上公認(rèn)的最先進(jìn)的生產(chǎn)工藝[11-12]。其優(yōu)點(diǎn)是勞動(dòng)強(qiáng)度低、質(zhì)量較好，可以大規(guī)模生產(chǎn)。其中熱浸提法是最常用的方法之一，目前已有學(xué)者利用熱浸法提取多種活性物質(zhì)，如多酚[13]、多糖[14]、葉綠素[15]、黃酮[16]等。但迄今為止，關(guān)于熱浸法提取辣椒中辣椒堿的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬采用熱浸法從朝天椒中提取辣椒堿類物質(zhì)，利用高效液相色譜法(HPLC)分析其含量，并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)熱浸法提取辣椒堿的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和分析，旨在為今后辣椒堿的生產(chǎn)工藝提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朝天椒、線椒、尖椒、杭椒、大豆油、壓榨花生油、葵花籽油：市售；

乙醇、甲醇：分析純，北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋：B-220 型，上海亞榮生化儀器廠；

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，美國(guó)安捷倫科技公司；

電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)：GZX-9140MBE型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

離心機(jī)：GZX-9140MBE型， 中鏡科儀技術(shù)有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熱浸法提取辣椒堿 稱取切碎的辣椒(邊長(zhǎng)0.5 cm)10 g，60 ℃的葵花籽油漂燙，用適量70%乙醇溶液室溫潤(rùn)濕10 min，再立即加入40 ℃的70%乙醇溶液30 mL，在此溫度下提取3 h，過(guò)濾，濾液以2 000 r/min 離心5 min，吸取上清液，測(cè)定辣椒堿的含量。

1.3.2 辣椒堿含量的測(cè)定 采用HPLC法。檢測(cè)條件：色譜柱為反相C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，甲醇—水(80∶20，體積比)溶液等度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。外標(biāo)法測(cè)定胡椒堿的含量，胡椒堿的提取率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

Y——辣椒堿提取率，%；

C1——提取液中的辣椒堿含量，mg；

C2——辣椒的質(zhì)量，mg。

1.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一樣品提取液連續(xù)進(jìn)樣6 次，對(duì)提取液中的辣椒堿進(jìn)行分析，記錄峰面積。

1.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試樣品溶液，平行測(cè)定6次，考察HPLC 測(cè)定的重復(fù)性[17]。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取某一樣品溶液1.0 mL，按上述方法操作，分別于第 10，30，50，70，90，130 min測(cè)定1次峰面積。

1.3.6 加標(biāo)回收率 精確稱量10.0 mg辣椒堿標(biāo)品，置于干燥器中干燥過(guò)夜，然后置于10 mL容量瓶，加適量甲醇，超聲溶解，再加甲醇定容，配制對(duì)照品溶液。采用加樣回收法，取切碎辣椒樣品，設(shè)計(jì) 6 組平行試驗(yàn)，每組3份分別添加0.20，0.30，0.40 mL 對(duì)照品溶液，按1.3.1項(xiàng)所描述進(jìn)行樣品處理后，進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.4 提取工藝條件的優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 辣椒品種：以葵花籽油為漂燙油，在辣椒邊長(zhǎng)0.5 cm，漂燙溫度60 ℃，浸提溫度40 ℃，浸提時(shí)間3 h條件下，考察不同辣椒種類(尖椒、杭椒、線椒、朝天椒)對(duì)辣椒堿提取率的影響。

(2) 漂燙溫度：以朝天椒為原料，葵花籽油為漂燙油，在辣椒邊長(zhǎng)0.5 cm，浸提溫度40 ℃，浸提時(shí)間3 h條件下，考察漂燙溫度(20，40，60，80，100，120，140，160，180 ℃)對(duì)辣椒堿提取率的影響。

(3) 漂燙油：以朝天椒為原料，在辣椒邊長(zhǎng)0.5 cm，漂燙溫度60 ℃，浸提溫度40 ℃，浸提時(shí)間3 h條件下，考察不同油脂(大豆油、葵花籽油、壓榨花生油)漂燙對(duì)辣椒堿提取率的影響。

(4) 切碎程度：以朝天椒為原料，葵花籽油為漂燙油，在漂燙溫度60 ℃，浸提溫度40 ℃，浸提時(shí)間3 h條件下，考察切碎程度(塊狀辣椒的邊長(zhǎng)分別為0.25，0.50，1.00，1.50，2.00 cm)對(duì)辣椒堿提取率的影響。

(5) 浸提溫度：以朝天椒為原料，葵花籽油為漂燙油，在辣椒邊長(zhǎng)0.5 cm，漂燙溫度60 ℃，浸提時(shí)間3 h條件下，考察浸提溫度(20，30，40，50，60 ℃)對(duì)辣椒堿提取率的影響。

(6) 浸提時(shí)間：以朝天椒為原料，葵花籽油為漂燙油，在辣椒邊長(zhǎng)0.5 cm，漂燙溫度60 ℃，浸提溫度40 ℃條件下，考察浸提時(shí)間(1，2，3，4，5 h)對(duì)辣椒堿提取率的影響。

1.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以辣椒堿提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇對(duì)辣椒堿提取率效果影響較大的因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化熱浸法提取辣椒堿的最佳工藝參數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值表示，采用 Spass統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用HPLC法繪制的辣椒堿的標(biāo)準(zhǔn)曲如圖1所示，線性方程為y=4 270.6x-10.564(r2=0.999 9)，線性范圍為 0.01～0.50 mg/mL。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 辣椒品種的影響 由圖2可知，朝天椒樣品提取液得到的辣椒堿的提取率最大。因此，選定朝天椒作為本試驗(yàn)的試驗(yàn)材料。

圖1 辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同品種辣椒中辣椒堿提取率的比較

2.2.2 漂燙的影響 由圖3 可知，漂燙之后辣椒堿的提取率有明顯的提高，可能是漂燙有利于殺滅辣椒的酶系，從而促進(jìn)辣椒堿的釋放。同時(shí)，辣椒堿提取率隨漂燙溫度的升高先增加后降低(圖4)，漂燙溫度為60 ℃時(shí)，提取率最高，可能是當(dāng)溫度較高時(shí)容易破壞辣椒的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而使辣椒堿更容易溶出，但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，辣椒堿可能會(huì)發(fā)生部分分解從而導(dǎo)致辣椒堿的提取率降低[18]。

圖3 漂燙工藝對(duì)朝天椒中辣椒堿提取率的影響

圖4 漂燙溫度對(duì)朝天椒中辣椒堿提取率的影響

2.2.3 漂燙油脂的影響 圖5顯示，使用葵花籽油進(jìn)行漂燙，辣椒堿的提取效果最好。因此，選取葵花籽油作為辣椒前處理的漂燙油脂。

圖5 漂燙油脂對(duì)朝天椒中辣椒堿提取率的影響

2.2.4 朝天椒切碎程度的影響 由圖6可知，在一定的破碎程度范圍內(nèi)，隨著辣椒塊的減小，辣椒堿的提取率先增加后降低，當(dāng)辣椒塊邊長(zhǎng)為0.5 cm時(shí)，提取率最高?？赡苁抢苯穳K的尺寸越小，物料與有機(jī)溶劑的接觸面積就越大，辣椒堿的滲透作用就較為明顯，有利于辣椒堿的溶出[19]，但過(guò)小的辣椒尺寸可能導(dǎo)致提取液中雜質(zhì)的溶出較多，導(dǎo)致分離純化困難[20]。

圖6 切碎程度對(duì)朝天椒中辣椒堿提取率的影響

2.2.5 浸提溫度的影響 如圖7所示。隨浸提溫度的升高，辣椒堿的提取率先增加后降低，當(dāng)浸提溫度為40 ℃時(shí)，提取率最高。這是由于溫度升高可加劇分子間的熱運(yùn)動(dòng)[21]，增加辣椒中辣椒堿物質(zhì)的溶出率，而溫度升高，會(huì)加速乙醇揮發(fā)而影響提取效果，同時(shí)過(guò)高的溫度可能會(huì)破壞辣椒堿的結(jié)構(gòu)，而使得辣椒堿的提取率下降[22]。

2.2.6 浸提時(shí)間的影響 浸提時(shí)間對(duì)朝天椒中辣椒堿提取率的影響如圖8所示。浸提時(shí)間與浸提溫度對(duì)辣椒堿提取率的影響是一致的，且是聯(lián)動(dòng)的，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，辣椒堿的提取率同樣是先增加后降低，且提取率在2～3 h時(shí)增加的較多，當(dāng)提取時(shí)間為3 h時(shí)，提取率達(dá)到最高。這可能是提取時(shí)間的延長(zhǎng)使提取溶劑有足夠的時(shí)間與辣椒作用，從而有利于辣椒堿的溶出[23]，且在初始的時(shí)間里，辣椒堿類物質(zhì)已基本被完全溶出，同時(shí)過(guò)長(zhǎng)的提取時(shí)間還可能增加雜質(zhì)的溶出量[9,24]。

圖7 浸提溫度對(duì)朝天椒中辣椒堿提取率的影響

圖8 浸提時(shí)間對(duì)朝天椒中辣椒堿提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 選定葵花籽油作為辣椒前處理的漂燙油脂，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)辣椒堿提取率影響效果較大的4個(gè)因素——漂燙溫度、浸提溫度、浸提時(shí)間以及切碎程度進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可見(jiàn)，最優(yōu)的水平組合為A2B2C3D1，即漂燙溫度60 ℃，浸提溫度40 ℃，浸提時(shí)間4 h，辣椒塊邊長(zhǎng) 0.25 cm，此時(shí)朝天椒中辣椒堿的提取率為0.23%，且各因素對(duì)辣椒堿的提取率影響的主次順序?yàn)椋浩癄C溫度>切碎程度>浸提溫度>浸提時(shí)間。另外，由正交試驗(yàn)預(yù)測(cè)的最優(yōu)方案為A2B2C2D2和A2B2C3D2，這2種方案并未出現(xiàn)在已有的試驗(yàn)方案中，因此對(duì)這2種方案進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可見(jiàn)，當(dāng)試驗(yàn)方案為A2B2C2D2時(shí)，即漂燙溫度60 ℃，浸提溫度40 ℃，浸提時(shí)間3 h，辣椒塊邊長(zhǎng)0.5 cm，辣椒堿的提取率最大，可達(dá)0.27%。對(duì)優(yōu)化后的熱浸法和有關(guān)朝天椒中辣椒堿粗提取的傳統(tǒng)提取方法如乙醇回流法、超聲輔助有機(jī)溶劑法、堿性乙醇法及其他提取方法如減壓內(nèi)部沸騰法[25-27]進(jìn)行比較，辣椒堿提取率對(duì)比見(jiàn)表4。由表4可知，采用熱浸法從朝天椒中提取辣椒堿的提取率有明顯提高。

2.3.2 精密度及重復(fù)性 精密度及重復(fù)性試驗(yàn)表明，辣椒堿提取液的HPLC 分析結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.54%和0.76%，表明儀器精密度良好，符合試驗(yàn)要求。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 采用不同工藝從朝天椒中提取辣椒堿的提取率

2.3.3 穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果顯示，RSD為1.02%，供試樣品在130 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。在空白的朝天椒樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率為98.56%～99.71%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.69%～0.94%(表5)，表明該方法可以滿足對(duì)辣椒堿樣品的分析測(cè)試要求。

表5 添加回收率結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用熱浸法提取朝天椒中的辣椒堿，從傳質(zhì)角度看，辣椒中辣椒堿浸提過(guò)程是辣椒堿從辣椒(固相)向溶液(液相)進(jìn)行擴(kuò)散的兩相間傳質(zhì)過(guò)程，即溶劑滲透進(jìn)入辣椒細(xì)胞內(nèi)部，內(nèi)部辣椒堿被溶劑溶解后向辣椒細(xì)胞表面擴(kuò)散，以及辣椒堿由辣椒細(xì)胞表面向溶液主體擴(kuò)散3個(gè)過(guò)程同時(shí)發(fā)生。對(duì)于辣椒堿的提取，辣椒細(xì)胞內(nèi)辣椒堿的溶解可在瞬間完成，而辣椒堿在辣椒細(xì)胞顆粒內(nèi)外的擴(kuò)散過(guò)程相對(duì)于滲透和辣椒堿溶解是一個(gè)較慢的過(guò)程，其在熱浸提中起主要作用。通過(guò)對(duì)辣椒進(jìn)行一系列前處理，促進(jìn)辣椒堿的溶出，以期增大后期有機(jī)溶劑的辣椒堿的溶解率，同時(shí)對(duì)后續(xù)的試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，最大化地促進(jìn)辣椒堿在辣椒細(xì)胞顆粒內(nèi)外的擴(kuò)散過(guò)程，從而提高辣椒堿的提取率。通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化出的熱浸法提取朝天椒中辣椒堿的最佳工藝條件為：漂燙溫度60 ℃，浸提溫度40 ℃，浸提時(shí)間3 h，辣椒塊邊長(zhǎng)0.5 cm，此時(shí)辣椒堿的提取率可達(dá)0.27%。與傳統(tǒng)的乙醇回流法、超聲輔助有機(jī)溶劑法、堿性乙醇法及其他朝天椒中辣椒堿的提取方法如減壓內(nèi)部沸騰法相比，辣椒堿的提取率都有明顯提高。

有關(guān)辣椒堿的提取方法有很多，本試驗(yàn)提供了一種新型的辣椒堿的提取方法，但該方法也存在一些問(wèn)題，如提取時(shí)間較長(zhǎng)、有機(jī)溶劑的殘留等，后期可通過(guò)微波、超聲輔助等方法提高提取效率，并減少有機(jī)溶劑的使用量，以切實(shí)為辣椒堿的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供指導(dǎo)。