楊錫洪渠純純李 賽李安奇丁 乾李鈺金李麗迪張俊逸解萬(wàn)翠

(1. 青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266042；2. 山東省生物化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266042；3. 農(nóng)業(yè)部冷凍調(diào)理海洋食品食點(diǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 榮成 264303；4. 榮成泰祥食品股份有限公司，山東 榮成 264303；5. 青島信和源生物科技有限公司，山東 青島 266002)

生物體中活性氧(ROS)和活性氮(RNS)作為在體內(nèi)發(fā)揮重要作用的自由基，參與細(xì)胞內(nèi)信息傳遞過(guò)程，并可防御病原體入侵[1]。但過(guò)量的自由基會(huì)對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和膜等各種細(xì)胞組分造成氧化損傷。氧化損傷是導(dǎo)致人體衰老和各種疾病如糖尿病、心臟病、中風(fēng)、動(dòng)脈硬化和癌癥等的重要因素[2]。研究[3]表明，攝入一定量的抗氧化劑能有效延緩衰老，預(yù)防或治療相關(guān)疾病。同時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)也是造成食品酸敗的主要原因，不僅降低了食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還會(huì)產(chǎn)生不良?xì)馕都耙恍┯泻ξ镔|(zhì)[4]?？寡趸瘎┛赏ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)移氫原子或電子直接清除自由基，或通過(guò)金屬離子螯合作用，抑制自由基的形成，有效阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[5]。合成抗氧化劑如二丁基羥基甲苯(BHT)、叔丁基羥基茴香醚(BHA)和沒(méi)食子酸丙酯(PG)等，雖能有效清除自由基，但其潛在的副作用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，且成本較高、易產(chǎn)生污染[6]。而天然抗氧化劑具有來(lái)源廣泛、成本低且無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，在越來(lái)越多的行業(yè)中得到應(yīng)用。

生物活性肽具備廣泛活性，如抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)、降高血壓和免疫調(diào)節(jié)等[7]。因此，以生物活性肽作為天然抗氧化劑不僅可阻斷有害的氧化反應(yīng)，還對(duì)人體有其他保護(hù)作用。

中國(guó)貝類產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛[8]，貝類及其加工副產(chǎn)物蛋白質(zhì)豐富，脂肪含量低，是獲取天然抗氧化肽的重要原料[9]。酶解法制備抗氧化肽是目前較為廣泛的方法[10]。隨著現(xiàn)代生物工程的發(fā)展，利用基因工程及發(fā)酵工程制備貝類源抗氧化肽也取得了一定成果[11]。本文綜述了國(guó)內(nèi)外貝類及其副產(chǎn)物制備抗氧化肽的研究進(jìn)展，以期對(duì)貝類源新資源的高值化利用提供基礎(chǔ)。

1 可控性酶解處理方法及優(yōu)化

由貝類蛋白制備抗氧化肽通常有化學(xué)水解法、微生物發(fā)酵法和酶解法等?；瘜W(xué)水解法利用酸或堿降解蛋白質(zhì)獲得活性肽，工藝簡(jiǎn)單、成本低，但水解進(jìn)程不易控制，而且酸堿易導(dǎo)致氨基酸或肽的結(jié)構(gòu)受損，影響生物活性，同時(shí)易造成環(huán)境問(wèn)題使其應(yīng)用受到限制[12]；微生物發(fā)酵法指利用一定的微生物進(jìn)行發(fā)酵，以此產(chǎn)生的酶能將蛋白質(zhì)水解從而獲得活性肽，成本較低，但發(fā)酵周期長(zhǎng)，生成的產(chǎn)物復(fù)雜使得提純過(guò)程困難[13]；酶解法生產(chǎn)肽類具有成本低、條件溫和、產(chǎn)品安全性高等優(yōu)點(diǎn)，并且水解進(jìn)程易于控制，廣泛應(yīng)用于制備貝類源抗氧化肽。

蛋白質(zhì)的酶促降解受諸多因素影響，使得水解產(chǎn)物的氨基酸組成和分子量大小各異，進(jìn)而影響肽的抗氧化活性[14]。利用可控酶解技術(shù)研究蛋白酶品種、底物濃度、酶用量、pH值、酶解時(shí)間及酶解溫度對(duì)酶解液水解度、得肽率和抗氧化活性的影響，以獲得最佳酶解工藝條件，能高效制備抗氧化肽[15]。圖1所示為可控酶法制備貝類源抗氧化肽的一般過(guò)程。

制備貝類源抗氧化肽的酶解方式主要包括單酶酶解、復(fù)合酶解和分段酶解。單酶酶解操作簡(jiǎn)單，酶解條件易于控制，但因蛋白酶水解位點(diǎn)高度專一，很難達(dá)到預(yù)期效果[17]。復(fù)合酶解指采用2種或2種以上蛋白酶按照一定比例同時(shí)酶解底物，分段酶解指采用多種蛋白酶依次酶解底物，與單酶酶解相比，這2種方法可有效提高酶解效率，但酶解過(guò)程中需要控制的條件較多[18]。目前應(yīng)用于貝類源抗氧化肽生產(chǎn)的常見(jiàn)酶有：動(dòng)物源蛋白酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶；植物源蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶；微生物源蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶、蠟樣芽胞桿菌蛋白酶等。表1列出了利用海洋貝類及其副產(chǎn)物源制備抗氧化肽的主要方法和結(jié)果。

由于蛋白酶具有特定的酶切位點(diǎn)，同一底物經(jīng)不同蛋白酶酶解后，所得產(chǎn)物的抗氧化活性差異較大[27]。因此，在制備貝類源抗氧化肽時(shí)要根據(jù)原料及試驗(yàn)條件挑選合適的蛋白酶，并研究出最佳酶解條件以獲得較多高抗氧化活性的肽。酶解結(jié)束后還需對(duì)酶解液進(jìn)行分離、純化、富集及活性檢測(cè)，以得到高純度和高活性的抗氧化肽，利于對(duì)發(fā)揮抗氧化活性組分的進(jìn)一步研究。

圖1 貝類及其副產(chǎn)品制備抗氧化肽的工藝流程[16]

2 肽的分離純化

研究[28]發(fā)現(xiàn)分子量較小的肽往往表現(xiàn)出更高的抗氧化活性。如表1中所示，經(jīng)不同貝類獲得的抗氧化肽分子量大多處于400～1 500 Da。為獲得具高抗氧化活性的肽組分，需采用一定方法對(duì)酶解液中的小分子肽進(jìn)行分離富集，常用的分離技術(shù)包括超濾法、色譜法和色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

超濾法常用于抗氧化肽的初步分離，即通過(guò)特定截留分子量規(guī)格的多孔膜實(shí)現(xiàn)對(duì)酶解液的分級(jí)，如Li等[24]分別利用3，5，10 kDa的超濾膜對(duì)短頸蛤水解液進(jìn)行分離，得到具有不同分子質(zhì)量范圍的多個(gè)肽組分。超濾法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需添加其他化學(xué)試劑，但超濾過(guò)程中易出現(xiàn)濃差極化使得分離不徹底，常采用色譜法對(duì)超濾后的組分進(jìn)一步純化分離，有時(shí)也會(huì)同時(shí)采用兩種方法以提高分離效果[29]。

色譜法包括離子交換色譜法(IEC)、分子排阻色譜法(SEC)以及反相高效液相色譜法(RP-HPLC)等。其中，IEC又分為陰離子交換色譜(AEC)和陽(yáng)離子交換色譜(CEC)，即以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分與離子交換劑的結(jié)合力大小差別達(dá)到分離目的。SEC是根據(jù)蛋白質(zhì)和多肽的分子量大小不同，其通過(guò)填充柱中的凝膠介質(zhì)速度不同而實(shí)現(xiàn)分離濃縮的，常以Sephadex G-15、Sephadex G-25和Sephadex G-50作為固定相。 如Asha等[21]用30%的乙腈和0.1%的三氟乙酸用作為洗脫液，用Sephadex G-25柱分離了分子量為1～5 kDa的牡蠣酶解液組分，在214 nm處檢測(cè)獲得了吸收峰。RP-HPLC分離效率高，通常為純化抗氧化肽的最后一步。體系由非極性固定相和極性流動(dòng)相組成，常以C18作為固定相，用乙腈或甲醇作為流動(dòng)相，將洗脫餾分在特定波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，以得到具有最高活性的抗氧化肽組分。Wu 等[25]獲得SEC富集的抗氧化肽后，采用半制備Zorbax SB C18柱，以超純水、0.1%三氟乙酸和甲醇為流動(dòng)相，在一定洗脫程序下獲得了5組純化的肽，測(cè)定各自的抗氧化活性后選擇活性最高的組分用于氨基酸序列測(cè)定。

色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以其自動(dòng)化和高效的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于抗氧化肽的分離純化，如氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)、超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)等。Umayaparvathi 等[20]利用Sephadex G-25凝膠柱獲得牡蠣酶解液中抗氧化活性最高的組分F5后，運(yùn)用UPLC-MS對(duì)其進(jìn)行分離純化，洗脫收集到的7個(gè)肽組分都能有效清除DPPH自由基，其中清除活性最強(qiáng)的3個(gè)組分則經(jīng) Q-TOF ESI質(zhì)譜儀獲得了分子量及氨基酸序列(見(jiàn)表1)。Neves等[30]采用UPLC-MS/MS純化并鑒定了鮭魚(yú)蛋白酶解液中的十六肽stp-c1的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)肽序列Tyr-Pro的氧自由基吸收能力(ORAC)最強(qiáng)。將色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)運(yùn)用于分離及鑒定抗氧化肽不僅能達(dá)到更好的分離效果，還能有效簡(jiǎn)化測(cè)序過(guò)程。

抗氧化肽的分離純化方法多樣，作為結(jié)構(gòu)鑒定前必不可少的一步，研究中應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆蛛x純化手段逐步得到高純度、高活性的抗氧化成分，以利于對(duì)其進(jìn)行更深入的研究。

表1 海洋貝類及其副產(chǎn)物源抗氧化肽

3 抗氧化肽活性檢測(cè)及結(jié)構(gòu)鑒定

3.1 抗氧化肽活性檢測(cè)方法

3.1.1 化學(xué)法檢測(cè)評(píng)價(jià) 肽組分在分離純化前，需檢測(cè)其抗氧化活性以篩選最佳產(chǎn)物，研究中常測(cè)定兩種以上指標(biāo)相互驗(yàn)證以表征肽的體外抗氧化活性[31]。肽對(duì)各類自由基如·OH、O2·-及NO·等的清除力，最直接地反映了其抗氧化活性；金屬離子螯合能力，即肽與環(huán)境中的金屬離子螯合，降低或消除金屬離子對(duì)生物細(xì)胞毒性危害的能力[32]；還原力指肽提供氫原子或電子的能力，具有較高還原力時(shí)供電子能力也越強(qiáng)[33]。此外，抗氧化肽的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制力也是檢測(cè)其氧化活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。機(jī)體內(nèi)多不飽和脂肪中的碳碳雙鍵(C═C)會(huì)降低碳?xì)滏I的作用力，使氫原子易受自由基攻擊，從而引起脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，如圖2所示。含疏水性氨基酸的抗氧化肽因其具有較高的脂溶性，增強(qiáng)了與脂肪酸反應(yīng)，有效防止氫原子受到攻擊，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[34]。但生物體內(nèi)存在著復(fù)雜的氧化過(guò)程，在體外抗氧化活性較強(qiáng)的肽在生物體內(nèi)不一定具有同樣的效果。因此，在化學(xué)方法評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上需進(jìn)一步結(jié)合生物試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)[35]。

圖2 不飽和脂肪酸氧化過(guò)程圖[34]

3.2 肽的分子量及氨基酸序列測(cè)定

肽序列組成以及其氨基酸殘基被認(rèn)為是影響肽抗氧化活性的重要因素[37]。液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)是鑒定多肽序列和分子量的常用方法，通常配備電噴霧電離源(ESI)、聯(lián)用混合四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Q-TOF mass)或三重四極桿—線性離子阱質(zhì)譜儀對(duì)純化的抗氧化肽進(jìn)行精確測(cè)序和分子量測(cè)定，與蛋白質(zhì)測(cè)序儀的聯(lián)用可提高測(cè)序結(jié)果的精準(zhǔn)性[21]。此外，埃德曼降解法(Edman degradation)也可用于測(cè)定肽的氨基酸序列，從蛋白質(zhì)或多肽氨基末端進(jìn)行分析。因?yàn)榇朔ㄊ且援惲蚯杷岜锦?duì)N-端氨基的修飾為基礎(chǔ)，當(dāng)N-端被其他化學(xué)基團(tuán)所封閉時(shí)需要先去除這些基團(tuán)才能進(jìn)行測(cè)序，且無(wú)法得到序列的分子量，有一定的局限性[38]。Chi等[29]對(duì)毛蛤分離純化后所得的抗氧化肽段測(cè)序，得其序列為Trp-Pro-Pro；Kleekayai等[39]分別從蝦醬水體液得到具有抗氧化作用的肽段，經(jīng)鑒定的序列為Trp-Pro，如圖3所示。Ongonierma等[40]也提出Trp-Pro具有二肽基肽酶(DPP-IV)抑制活性。Herraiz等[41]也發(fā)現(xiàn)含有氨基酸色氨酸Trp的小分子肽能夠提供電子以達(dá)到消除陽(yáng)離子的作用，特別是ABTS自由基。

圖3 具有抗氧化活性的氨基酸序列

鑒定具有抗氧化活性肽段的分子量和氨基酸序列，不僅對(duì)抗氧化肽構(gòu)效關(guān)系的深層研究具有重要意義，同時(shí)對(duì)于天然抗氧化肽的體外合成有一定的參考價(jià)值，借助這一方法也為合成高活性抗氧化肽能指出新的發(fā)展方向。

4 抗氧化肽構(gòu)效研究

多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸所含基團(tuán)、親疏水性、酸堿性及序列，空間構(gòu)象都會(huì)對(duì)抗氧化肽活性產(chǎn)生影響。理解結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系(SAR)有助于預(yù)測(cè)肽中潛在的抗氧化活性物質(zhì)，開(kāi)發(fā)新的高活性抗氧化肽[42]。

4.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸組成和序列

氨基酸組成和序列是影響肽抗氧化活性的重要因素[43]。表1給出了近年來(lái)部分貝類源抗氧化肽的氨基酸組成與序列，可以看出，這些抗氧化肽的氨基酸序列間同源性甚微，或因其制備原料、水解酶和酶解方式不同造成。研究[44]發(fā)現(xiàn)，大部分抗氧化性強(qiáng)的肽除含有Pro、His、Tyr、Trp、Met和Cys等疏水性氨基酸之外，其N端還常含有疏水性殘基?？寡趸闹惺杷园被岬闹緹N側(cè)鏈?zhǔn)蛊渑c自由基更易結(jié)合，增強(qiáng)肽與多不飽和脂肪酸的反應(yīng)，從而延緩脂質(zhì)的過(guò)氧化進(jìn)程[45]。因此，疏水性氨基酸是影響肽抗氧化活性的重要因素。Giménez等[46]研究了3種具有相同分子量的肽：GPLGLLGFLGP-LGLS、GPOGOOGFOGPOGOS和GPOGOOGFLGPOGOS，發(fā)現(xiàn)其中疏水性最強(qiáng)的GPLGLLGFLGPLGLS抗氧化活性也最強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)了疏水性與肽段的抗氧化活性的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。含組氨酸的肽可通過(guò)供氫、捕獲脂質(zhì)過(guò)氧自由基或利用咪唑基團(tuán)的金屬離子螯合作用發(fā)揮其抗氧化作用[47]；肽中的芳香族氨基酸殘基(如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)可以向缺電子自由基提供質(zhì)子從而表現(xiàn)抗氧化性[48]。Wu等[49]從扇貝雌性性腺中分離出2種分子量相似的肽HMSY(536 Da)和PEASY(565 Da)，通過(guò)對(duì)其抗氧化活性的比較證明了該觀點(diǎn)。

此外，在對(duì)一些具有脂質(zhì)過(guò)氧化性的貝類源結(jié)構(gòu)鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，該類肽具有兩親性。兩親性肽能夠存在于油—水界面，有效猝滅亞油酸乳液體系的水相和油相中的自由基，從而使肽具有抗氧化活性[46]。肽的親脂性和親水性氨基酸殘基可共同作用，促進(jìn)其與疏水性靶標(biāo)的結(jié)合，從而激發(fā)肽的總體抗氧化活性[34]。

以Suetsuna等[44]從酪蛋白水解物中分離出的抗氧化肽Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu為例，如圖4所示，N端多為疏水性氨基酸(如Val、Leu等)，在細(xì)胞膜水油層界面處，疏水氨基酸有利于抗氧化肽直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行ROS清除反應(yīng)；C端的Cys含易結(jié)合自由基(如ROOR、ROO· 、R· 、HO·等)結(jié)合的巰基，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[43]，發(fā)揮抗氧化作用。

圖4 兩親性抗氧化肽作用機(jī)理[43]

4.2 空間構(gòu)象影響

多肽的空間構(gòu)象(二級(jí)結(jié)構(gòu)、二硫鍵等)也會(huì)影響肽的抗氧化活性。Suetsuna等[44]利用蝦肌肉蛋白得到可抑制亞油酸過(guò)氧化的肽段IKK、FKK和FIKK，但將相同濃度的氨基酸混合卻無(wú)抗氧化活性，說(shuō)明肽鍵及多肽的結(jié)構(gòu)對(duì)抗氧化活性起重要作用。Chen等[50]在對(duì)合成肽進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，含有組氨酸的人工合成短肽在其單獨(dú)存在時(shí)，并不具有抗氧化能力，則在一定程度上說(shuō)明，肽的抗氧化性是所有短肽在一定空間結(jié)構(gòu)上的協(xié)同作用產(chǎn)生的。此外，韋緒芹等[51]認(rèn)為，通過(guò)人工合成貝類抗氧化肽的氨基酸序列，采用插入、替換或剔除的方法對(duì)肽空間構(gòu)象進(jìn)行修飾也會(huì)影響其抗氧化活性。

5 結(jié)論與展望

作為一種天然活性物質(zhì)，貝類源抗氧化肽的安全性高、毒副作用小，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，但目前相關(guān)研究中仍存在一些問(wèn)題：酶解法無(wú)法制得單一活性肽，且其富集、純化過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)；活性結(jié)構(gòu)序列測(cè)定繁瑣復(fù)雜，成本高；抗氧化肽構(gòu)效關(guān)系仍待進(jìn)一步驗(yàn)證；活性位點(diǎn)的分布及其作用機(jī)理、貝類源抗氧化肽與其他抗氧化劑之間是否存在協(xié)同或拮抗作用等問(wèn)題都值得深入研究。

除抗氧化性外，貝類源肽還具有抗菌性、光保護(hù)性和抗光老化活性等其他生物活性，因此被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)藥用化妝品的更安全的選擇。盡管貝類源抗氧化肽在醫(yī)學(xué)、食品、化妝品等行業(yè)的應(yīng)用潛力很大，但目前多數(shù)研究?jī)H處于試驗(yàn)階段，需要進(jìn)一步研究其商業(yè)化發(fā)展的安全性。此外，通過(guò)開(kāi)發(fā)一些補(bǔ)充劑，進(jìn)一步提高貝類源抗氧化肽的生物利用率和組織再生功效，增加其應(yīng)用潛力，也是一個(gè)具有前景的研究方向。