余惠敏

基因剪刀三兄弟

正如前面所說，CRISPR家有兄弟仨——三款基因剪刀，而其中的首款明星產(chǎn)品就是三兄弟之老大——CRISPR-Cas9，一經(jīng)推出就成為學(xué)界爆款“剪刀”。

此前，科學(xué)家們在實(shí)驗(yàn)室最常用的多功能基因組編輯工具就是CRISPR-Cas9，這是一種RNA 導(dǎo)向的核酸酶，可以切割DNA。

Cas9系統(tǒng)首先由美國加州大學(xué)伯克利分校Jennifer Doudna、瑞典于默奧大學(xué)Emmanuelle Charpentier和美國麻省理工學(xué)院- 哈佛大學(xué)博德研究所張鋒等實(shí)驗(yàn)室在2012年和2013年報(bào)道。

這個C家老大有多火爆？

Cas9有效地實(shí)現(xiàn)了哺乳動物基因組的編輯，并帶動了基因編輯領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，將基因編輯技術(shù)成功拓展到基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控、表觀遺傳修飾、全基因組功能篩選、堿基編輯、基因組成像和細(xì)胞譜系追蹤等多種生物學(xué)應(yīng)用。它能使基因組更有效地產(chǎn)生變化或突變，效率比既往基因編輯技術(shù)更高，讓CRISPR成為“生物科學(xué)領(lǐng)域的游戲規(guī)則改變者”，現(xiàn)已發(fā)展成為該領(lǐng)域最炙手可熱的研究工具之一。

而Cas9并非Cas蛋白家族中唯一一種RNA導(dǎo)向的核酸酶，除了它之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)Cas12a和Cas12b也具備成為基因剪刀的潛力。

如今，Cas12a已被開發(fā)成基因組編輯工具，張鋒等人在2015年發(fā)現(xiàn)并改造的Cas12a（又稱為Cpf1）系統(tǒng)，能實(shí)現(xiàn)哺乳動物等多個物種的基因組編輯。

Cas9、Cas12a、Cas12b 三種核酸酶的位點(diǎn)圖和蛋白結(jié)構(gòu)

這個老二比老大還優(yōu)秀

Cas12a相對于Cas9來說有一些優(yōu)勢：它比標(biāo)準(zhǔn)的Cas9要小，更容易進(jìn)入組織和細(xì)胞;它剪切時離識別位點(diǎn)很遠(yuǎn)，讓研究人員在編輯位置的選擇上有了更多的選擇。

于是，CRISPR基因剪刀的潛力者哥仨，就剩下Cas12b（又稱為C2c1）還沒被開發(fā)成功了！這種蛋白比Cas9或Cas12a更小，更容易通過病毒載體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間遞送，所以很可能是更好的基因剪刀。

特異性

目標(biāo)特異性是指基因剪刀只瞄準(zhǔn)那些為它們設(shè)定的目標(biāo)基因，更高的特異性意味著更高的精確性，這對一款功能強(qiáng)大的基因編輯工具來說非常重要。

張鋒團(tuán)隊(duì)的研究

為啥把有可能最棒的小弟剩下了？

因?yàn)镃as12b有嗜高溫的特性，很難開發(fā)成好用的基因編輯工具。Cas12b來自一種嗜酸耐熱菌，作為DNA裂解酶，它的最佳活性“工作環(huán)境”需要高達(dá)48℃的溫度。普通哺乳動物如果達(dá)到這種溫度，恐怕就要高燒死了吧！但達(dá)不到溫度要求，Cas12b的酶活性就不能發(fā)揮，會罷工喔！

張鋒團(tuán)隊(duì)對Cas12b進(jìn)行了研究，他們先在Cas12b蛋白家族中尋找到一種喜歡常溫的成員，鑒定出在37℃時能保持核酸酶活性的BhCas12b。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原始結(jié)構(gòu)的野生型BhCas12b會切割雙鏈DNA中的非靶標(biāo)單鏈，且溫度越低、錯誤越多，導(dǎo)致編輯效率較低。

為解決這一問題，張鋒團(tuán)隊(duì)對Cas12b重新進(jìn)行了設(shè)計(jì)，增強(qiáng)其在人體體溫37℃下的活性。根據(jù)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的線索，研究人員通過4個點(diǎn)位突變，讓酶的活性點(diǎn)位更容易和DNA靶序列接近，得到重新設(shè)計(jì)的新款Cas12b。

與Cas9相比，重新設(shè)計(jì)的Cas12b在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中對靶序列具有更高的特異性。畢竟，脫靶效應(yīng)是CRISPR技術(shù)最大的隱患之一：Cas9酶有時會在靶點(diǎn)以外的地方進(jìn)行切割，而這種切割有可能引起癌癥。

張鋒團(tuán)隊(duì)在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，針對多個基因的多個靶序列，考察了新款基因剪刀的編輯效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，新款Cas12b的編輯效率與Cas9、Cas12a相當(dāng)，甚至更高;而且新款Cas12b導(dǎo)致的錯誤插入缺失比常用的Cas9少得多，脫靶率顯著降低。

李偉團(tuán)隊(duì)的研究

不過，張鋒團(tuán)隊(duì)的這款Cas12b基因剪刀還不能算首發(fā)。

不久前的2018年11月27日，《細(xì)胞發(fā)現(xiàn)》（Cell Discovery）發(fā)表了中國科學(xué)院動物研究所研究員李偉團(tuán)隊(duì)的類似研究成果。該研究團(tuán)隊(duì)通過系統(tǒng)挖掘，成功地鑒定出若干能在人體生理溫度工作的Cas12b（C2c1）酶。經(jīng)過系統(tǒng)改造，有兩種Cas12b 酶被成功開發(fā)成為哺乳動物基因組編輯工具，能夠編輯人類細(xì)胞基因組并應(yīng)用于制備動物疾病模型。他們開發(fā)的來自酸性脂環(huán)酸芽孢桿菌（AaCas12b）的Cas12b，可以在31℃～59 ℃溫度范圍內(nèi)對哺乳動物基因組進(jìn)行編輯。

那篇論文展示了該工具的三大優(yōu)點(diǎn)：

一是Cas12b比應(yīng)用最為廣泛的SpCas9和Cas12a更小，因此更容易用于需要載體遞送的臨床基因治療;

二是Cas12b能夠在寬廣的溫度范圍和pH范圍保持高的酶活性，有望適用于具有不同生理溫度的多個物種。同時與SpCas9相比，Cas12b核糖核酸酶（RNP）在人血漿中更穩(wěn)定;三是Cas12b很難耐受向?qū)NA與靶DNA之間的堿基錯配，因此比SpCas9和Cas12a/Cpf1的脫靶效應(yīng)更小，這意味著它在進(jìn)行基因組編輯時更加安全。

針對這項(xiàng)新技術(shù)，該研究團(tuán)隊(duì)已于論文發(fā)表一年前提交了專利申請，并已開始開發(fā)這項(xiàng)技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用。

當(dāng)然，就像當(dāng)初Cas9那款基因剪刀的打磨不是一個團(tuán)隊(duì)完成的那樣，想要將Cas12b改造成和Cas9一樣應(yīng)用廣泛的工具，也還有很多工作要做。但第三個潛在基因組編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)，顯然將會帶給研究人員更多選擇。

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CRISPR 的專利大戰(zhàn)

此前，CRISPR基因編輯技術(shù)已經(jīng)因其巨大的商業(yè)價值引發(fā)了專利大戰(zhàn)。其中最引人注目的是張鋒所在的博德研究所和Jennifer Doudna所在的加州大學(xué)伯克利分校之間的專利之爭，因?yàn)檫@兩家機(jī)構(gòu)的專利范圍廣，對CRISPR-Cas9的大多數(shù)商業(yè)應(yīng)用至關(guān)重要。

加州大學(xué)伯克利分校提出的專利是不限于任何環(huán)境的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，博德研究所的專利主要為真核生物環(huán)境中的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。美國專利商標(biāo)局專利審判和上訴委員會曾于2017年2月作出關(guān)鍵裁決：麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)的博德研究所的專利，與加州大學(xué)伯克利分校的發(fā)現(xiàn)并不“沖突”，博德研究所可以保留其在真核生物中使用CRISPR-Cas9的專利。之后，加州大學(xué)伯克利分校提起上訴，2018年9月聯(lián)邦巡回上訴法院維持判決，張鋒所在機(jī)構(gòu)繼續(xù)占據(jù)上風(fēng)。

值得一提的是，專利判決并不會影響CRISPRCas9技術(shù)在科研領(lǐng)域的應(yīng)用。博德研究所方面稱，全世界的科研人員可以用他們的技術(shù)進(jìn)行學(xué)術(shù)研究，但是廠商必須付費(fèi)使用。