任晨春，郭東花，梁玥宏，王文靖，田秀英，崔洪艷，陳成彬，王玲紅，楊微微，張海霞，李曉旭

脊肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）作為最常見(jiàn)的一種常染色體隱性遺傳的致死性神經(jīng)、肌肉疾病，以發(fā)展性、成對(duì)稱(chēng)性的肌肉無(wú)力和萎縮作為主要的臨床特點(diǎn)，近側(cè)端肌肉受累嚴(yán)重于遠(yuǎn)端肌肉，下肢肌肉累及較上肢嚴(yán)重[1-3]。在常染色體隱性疾病中，SMA作為最為常見(jiàn)的致死性疾病之一，在新生兒中的發(fā)病率高達(dá)1/10 000~1/6 000，且人群致病基因的攜帶水平約為1/60～1/40[4-5]。據(jù)報(bào)道，我國(guó)SMA攜帶水平在不同檢測(cè)人群中也存在差異，約在1/72～1/39之間[6-10]。患兒家庭一般沒(méi)有此類(lèi)疾病的患者，所以患兒一經(jīng)出生就給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在超過(guò)95%的SMA患者中，存在SMN1基因的純合性缺失[11]，以SMN1的第7和第8外顯子（exon7、8，E7、E8）同時(shí)缺失或僅有SMN1 E7缺失為其具體表現(xiàn)，約5%的患者是由SMN1發(fā)生其他微小突變后雜合缺失引起。研究表明，造成SMA的首要原因是SMN1基因的缺失，因此檢測(cè)SMN1基因的缺失成為SMA分子檢測(cè)的首選方法[12]。本研究對(duì)孕婦進(jìn)行SMA無(wú)癥狀攜帶者的篩查，對(duì)篩查陽(yáng)性孕婦的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，尋求篩查和診斷SMA胎兒的新途徑，預(yù)防SMA患兒的出生。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2014年12月—2017年10月就診于天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科門(mén)診、接受常規(guī)產(chǎn)前檢查孕中期孕婦162例作為研究對(duì)象。年齡22～34歲，平均年齡（28.8±2.6）歲；孕周 16～18 周，平均（17.2±0.3）周。夫婦雙方均體健，無(wú)SMA相關(guān)臨床表現(xiàn)。夫婦雙方簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA的提取 取孕婦乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝外周血4 mL，利用離心柱法提取DNA，用分光光度儀測(cè)定DNA模板質(zhì)量，-20℃保存以防DNA降解。

1.2.2 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（QF-PCR）進(jìn)行SMN1 E7和E8測(cè)定 依據(jù)孟英韜等[13]的設(shè)計(jì)方案，針對(duì)SMN1和SMN2高度相似存在反向重復(fù)且僅有的5個(gè)特異性堿基差異的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出2種特異性引物分別為應(yīng)用于檢測(cè)存在于SMN1和SMN2第6內(nèi)含子到第7內(nèi)含子之間的4個(gè)堿基差異的引物1和應(yīng)用于檢測(cè)位于E8堿基差異的引物2。引物序列如下：引物1，上游5’-AGACTATCAACTTAATTTCTGATC-3’，下游 5’-CTGGTCTGCCTACTAGATAT-3’；引物 2，上游 5’-GTAATAACCAATGCATGTGAA-3’，下游 5’-CTACAACACCCTTCTCACAG-3’。

PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，40個(gè)循環(huán)（以95℃變性15 s、58℃退火60 s為每個(gè)循環(huán)條件）。選擇羧基熒光素（FAM）通道和綠色熒光蛋白（VIC）通道用于信號(hào)采集。PCR反應(yīng)后數(shù)據(jù)處理，ΔCT的計(jì)算方法：ΔCT=CT_FAM-CT_VIC，ΔΔCT=ΔCT_Sample-ΔCT_Standard（樣本 ΔCT減去 3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品ΔCT的平均值）。

SMN1 E7數(shù)據(jù)結(jié)果判讀依據(jù)：E7ΔΔCT≤-0.55為未檢出SMN1 E7缺失；-0.55＜E7ΔΔCT≤-0.45為臨界值；-0.45＜E7ΔΔCT≤0.45 為 SMN1 E7 雜合缺失型；0.45＜E7ΔΔCT≤0.80為臨界值；0.8＜E7ΔΔCT為 SMN1 E7純合缺失型。SMN1 E8數(shù)據(jù)結(jié)果判讀依據(jù)：E8ΔΔCT≤-0.55為未檢出SMN1 E8缺失；-0.55＜E8ΔΔCT ≤-0.45為臨界值；-0.45＜E8ΔΔCT≤0.45為 SMN1 E8雜合缺失型；0.45＜E8ΔΔCT≤1.5為臨界值；1.5＜E8ΔΔCT為SMN1 E8純合缺失型。

1.2.3 對(duì)篩查陽(yáng)性攜帶者孕婦配偶進(jìn)行SMN1 E7、E8檢測(cè)對(duì)經(jīng)QF-PCR篩查，基因型為SMN1 E7雜合缺失伴或不伴E8缺失孕婦定為陽(yáng)性攜帶者，對(duì)其配偶進(jìn)行SMN1 E7及E8檢測(cè)。

1.2.4 采用QF-PCR對(duì)羊水標(biāo)本進(jìn)行SMN1缺失測(cè)定 對(duì)夫婦雙方均為陽(yáng)性攜帶者的孕婦進(jìn)行羊水穿刺，抽取羊水10 mL，采用常規(guī)方法提取胎兒羊水DNA，采用QF-PCR對(duì)DNA模板SMN1 E7、E8缺失情況進(jìn)行診斷。同時(shí)采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）對(duì)胎兒的基因缺失情況進(jìn)行驗(yàn)證（本部分實(shí)驗(yàn)由金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所檢測(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取的質(zhì)量用離心柱法提取外周血DNA，濃度為 22.7～61.4 ng/μL，平均（36.8±12.1）ng/μL，OD260/OD280 在 1.75～1.89 之間。

2.2 QF-PCR對(duì)孕中期孕婦外周血DNA檢測(cè)結(jié)果在162例孕婦中不存在SMN1 E7、E8同時(shí)純合缺失情況。SMN1 E7雜合缺失6例，參照SMN1 E8的檢測(cè)情況，這6例E7雜合缺失病例中孕婦編號(hào)分別為No.81、No.128、No.130的3例表現(xiàn)為合并E8雜合缺失，孕婦編號(hào)分別為No.18、No.89、No.91未發(fā)現(xiàn)E8缺失。故162例孕婦共檢測(cè)出6例SMA致病基因攜帶者，攜帶者占樣本總?cè)藬?shù)的3.70%（6/162）。在6例攜帶者中，編號(hào)為No.128和No.130的孕婦配偶同樣為SMN1缺失的陽(yáng)性攜帶者，E7和E8都表現(xiàn)為雜合缺失。編號(hào)為No.18、No.81、No.89和No.91的4例孕婦配偶全部表現(xiàn)E7、E8正常型。孕婦中陽(yáng)性攜帶者以及其配偶的基因型檢出結(jié)果見(jiàn)表1。No.89孕婦的QF-PCR曲線(xiàn)圖見(jiàn)圖1。

對(duì)父母均為SMN1 E7雜合缺失的高危胎兒DNA采用QF-PCR進(jìn)行基因診斷，顯示2名胎兒中No.128孕婦胎兒為純合型患者（即SMN1 E7、E8均顯示為純合缺失），No．130孕婦胎兒基因型表現(xiàn)為與父母相同的SMN1 E7雜合缺失同時(shí)伴E8雜合缺失（即SMA致病基因攜帶者）。對(duì)上述2名胎兒同時(shí)采用MLPA方法進(jìn)行胎兒基因型的驗(yàn)證，結(jié)果表明2名胎兒中No.128孕婦家庭的胎兒基因型為SMN1 E7、E8均為純合缺失；No.130孕婦家庭的胎兒的基因型為SMN1 E7、E8均雜合缺失，其MLPA結(jié)果見(jiàn)圖2。兩種方法結(jié)果一致。

3 討論

我國(guó)是出生缺陷高發(fā)國(guó)家，據(jù)2017年衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年出生缺陷率高達(dá)5.6%，其中單基因遺傳病占出生缺陷的22.3%，是嬰兒致死致殘的重要原因。因此對(duì)單基因遺傳病攜帶者的產(chǎn)前篩查及診斷具有重要的意義。SMA作為一種常見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，給患兒家庭帶來(lái)極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。本研究對(duì)162例孕婦進(jìn)行SMN1缺失檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SMN1缺失的攜帶率約為1/27，高于文獻(xiàn)報(bào)道的1/72～1/39[6-10]，可能與檢測(cè)樣本量有限有關(guān)，也可能與天津地區(qū)高攜帶率有關(guān)，故對(duì)于天津地區(qū)的人群攜帶率需要進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行研究。

表1 篩查SMA攜帶者及其配偶的基因型表現(xiàn)

SMN1基因缺失是造成SMA的主要原因，對(duì)SMN1缺失的檢測(cè)方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)较拗菩云伍L(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（PCR-RFLP）、PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)（PCR-DHPLC）和MLPA等。PCR-RFLP方法雖較為簡(jiǎn)單易行，但對(duì)檢測(cè)SMN1雜合缺失尚存在局限性，僅能對(duì)SMN1基因純合缺失的SMA患兒進(jìn)行分子診斷[14]，因而不能應(yīng)用于人群中進(jìn)行SMA致病基因攜帶者的篩查；PCRDHPLC存在實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)背景受重復(fù)片段干擾較大、結(jié)果判讀困難等缺點(diǎn)，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件要求高。MLPA技術(shù)是目前檢測(cè)SMN1基因缺失的金標(biāo)準(zhǔn)，有準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[15]，不僅能檢出SMN1基因的純合缺失，還可對(duì)SMN1基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析[16]，但對(duì)DNA樣本質(zhì)量要求高、實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀相對(duì)復(fù)雜，商品化試劑價(jià)格也相對(duì)高昂[6]，暫難以作為篩查方式在基層衛(wèi)生機(jī)構(gòu)及大規(guī)模人群中普及。QF-PCR因其簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)成為檢測(cè)基因缺失的又一重要方法，本課題組曾對(duì)5個(gè)SMA家系分別采用QFPCR和MLPA方法檢測(cè)SMN1基因缺失情況，兩種方法結(jié)果一致。本研究應(yīng)用QF-PCR法對(duì)孕中期婦女SMN1 E7、E8的缺失情況進(jìn)行篩查，在保持QFPCR法檢測(cè)本身的成本低廉、實(shí)驗(yàn)快速準(zhǔn)確、操作步驟簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)流程不易被污染、可對(duì)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控、結(jié)果判讀較為直觀等傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)的同時(shí)[17]，依靠其完備的實(shí)驗(yàn)方案以及詳盡的數(shù)據(jù)解讀方法，使實(shí)驗(yàn)試劑各異、操作平臺(tái)不同、實(shí)驗(yàn)優(yōu)化不同等因素造成實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差、實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以通用識(shí)別的缺點(diǎn)得到基本克服，但本研究樣本有限，我們將通過(guò)增加病例的數(shù)量以進(jìn)一步研究該方法的敏感度和特異度，評(píng)估在人群中篩查的價(jià)值以及對(duì)產(chǎn)前診斷SMA胎兒的意義。該方法的局限性在于只能檢測(cè)基因的缺失，對(duì)有SMN1基因突變的攜帶者無(wú)法識(shí)別，故對(duì)有SMA家族史的孕婦應(yīng)采用QF-PCR法以及基因測(cè)序的方法聯(lián)合篩查效果更好。

圖1 No.89孕婦SMN1基因E7和E8的PCR曲線(xiàn)

圖2 No.130孕婦胎兒MLPA圖

本研究建立了SMA攜帶者篩查及對(duì)夫婦雙方攜帶者家庭進(jìn)行產(chǎn)前診斷的流程，采用QF-PCR方法先對(duì)孕婦SMN1 E7、E8的缺失情況進(jìn)行篩查。對(duì)篩查出陽(yáng)性的孕婦定義為攜帶者，然后對(duì)其配偶進(jìn)行SMN1 E7、E8的檢測(cè)，若其配偶是陰性的，征詢(xún)父母的意見(jiàn)是否做產(chǎn)前診斷，對(duì)出生后的嬰兒進(jìn)行隨訪(fǎng)。若其配偶是陽(yáng)性的定義為夫婦雙攜帶者，對(duì)其胎兒進(jìn)行羊水穿刺，采用QF-PCR方法診斷胎兒的基因型。本研究162例孕婦共篩查出6例SMA攜帶者，攜帶者占樣本總?cè)藬?shù)的3.70%，對(duì)其配偶進(jìn)行檢測(cè)，有2例為夫婦雙攜帶者。對(duì)這2例胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，1例為純合缺失，診斷為SMA患者，經(jīng)遺傳咨詢(xún)父母決定終止妊娠。另1例診斷為攜帶者，經(jīng)遺傳咨詢(xún)父母決定繼續(xù)妊娠，孕婦于孕39周順產(chǎn)，對(duì)嬰兒進(jìn)行體格檢查未見(jiàn)明顯異常。由此可見(jiàn)，采用規(guī)范的產(chǎn)前篩查及診斷流程對(duì)于SMA攜帶者夫婦做出適當(dāng)?shù)倪x擇以及減少SMA患兒的出生都具有重要的意義。