劉 佳，何炫程，項(xiàng) 晨，馬伯寧，韋航濤，楊明峰

(北京農(nóng)學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

目前藻類的研究正在日益深入，其藥性價(jià)值與保健功效正成為人們研究的熱點(diǎn)[4]。與此同時(shí)藻類的轉(zhuǎn)基因技術(shù)也取得了較大的進(jìn)展，已經(jīng)出現(xiàn)了越來(lái)越多關(guān)于轉(zhuǎn)基因藻類的成功案例，如秦松[5]等將GUS基因?qū)牒衷寮?xì)胞，呂玉民[6]等用基因槍法將bar基因?qū)攵攀消}藻其中，其中將基因?qū)朐嗽孱惐容^容易成功，而真核藻類的則相對(duì)較少。關(guān)于藻類轉(zhuǎn)化的方法目前有基因槍法、玻璃珠法、電轉(zhuǎn)化法等，而電轉(zhuǎn)化法由于簡(jiǎn)單快捷、費(fèi)用低廉等特點(diǎn)，具有明顯的優(yōu)勢(shì)[7]。在藻類轉(zhuǎn)化方法研究中，常用到的報(bào)告基因有綠色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、硝酸還原酶基因和葡萄糖苷酸酶基因等，此類方法可鑒之處是結(jié)果可用肉眼觀測(cè)，具有操作方便且基因易于檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，因此在藻類的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)中應(yīng)用比較廣泛。耿秋貴[8]強(qiáng)調(diào)若想讓外源基因?qū)刖托枰邢鄬?duì)較強(qiáng)的場(chǎng)強(qiáng)和較長(zhǎng)的電擊時(shí)間，但這會(huì)使細(xì)胞死亡率大大增加，最終影響到轉(zhuǎn)化率。

藻類高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)必須滿足[9]轉(zhuǎn)化率必須較高、導(dǎo)入的基因必須靈敏表達(dá)、轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞可以正常培養(yǎng)。盡管萊茵衣藻是目前研究轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一種良好材料，但仍存在轉(zhuǎn)化率不高的問(wèn)題。為了尋求萊茵衣藻較好的轉(zhuǎn)化條件，研究以萊茵衣藻野生型WT和無(wú)細(xì)胞壁突變體CC425為材料，利用電擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，探索較為合適的抗生素篩選濃度、電擊場(chǎng)強(qiáng)和電擊時(shí)間，以提高衣藻的電擊轉(zhuǎn)化效率，為萊茵衣藻的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

萊茵衣藻材料野生型WT和細(xì)胞壁缺失突變型CC425是由首都師范大學(xué)胡勇副教授惠贈(zèng)。研究所用pChalic-2ATG-GFP與pChlalic-4CL-3a-STS質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室保存，載體帶有抗性基因(aphVIII)。所用質(zhì)粒在E.coliDH5α中培養(yǎng)擴(kuò)增，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，質(zhì)粒的濃度用紫外分光光度儀測(cè)定。

細(xì)菌培養(yǎng)以LB培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，萊茵衣藻以TAP培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥品及精密儀器 磷酸緩沖液、微量元素、氨芐青霉素(ampicillin，Amp)儲(chǔ)液、巴龍霉素(paromomycin，Par)儲(chǔ)液、鮭魚(yú)精(Salmon sperm)DNA儲(chǔ)液。

使用的儀器有Eppendorf AG 22331PCR儀，DYY-6C核酸電泳儀、水平電泳槽，Delta320數(shù)字式pH計(jì)，KL-211GZ恒溫光照培養(yǎng)搖床，TH2-312恒溫培養(yǎng)搖床，Mettler toledo AL204精密電子天平，賽福SFG-02.500超凈工作臺(tái)，WD-9403C紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，AlphaImager HP電泳圖像分析系統(tǒng)，貝克曼冷凍離心機(jī)和Leica激光掃描共聚焦顯微鏡。

1.2.2 引物序列 根據(jù)4CL-3a-STS設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列：4-3-S F 5′-TTGGAGGTACGACCGAGATGGC-3′，4-3-S R 5′-GGATGGCC GATTTCGCTGAT-3′。所有引物在北京睿博生物公司合成。

在小學(xué)數(shù)學(xué)教學(xué)中，很多教師認(rèn)為要想打好小學(xué)生的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)，就應(yīng)該重視知識(shí)的傳授，牢記數(shù)學(xué)知識(shí)點(diǎn)，這樣才能為后期教學(xué)奠定良好的基礎(chǔ)，即便在記憶中容易產(chǎn)生遺忘，但通過(guò)反復(fù)鞏固依舊可以達(dá)到教學(xué)的效果。在這一教學(xué)理念下，很多的教師并不重視實(shí)踐活動(dòng)課教學(xué)，甚至直接忽略了這一流程，影響了小學(xué)數(shù)學(xué)實(shí)踐課程教學(xué)的效果。

1.2.3 質(zhì)粒提取 參照康為世紀(jì)生物科技有限公司高純度質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)上的具體步驟操作，進(jìn)行質(zhì)粒pChalic-2ATG-GFP和pChlalic-4CL-3a-STS的提取。

1.2.4 萊茵衣藻遺傳轉(zhuǎn)化 萊茵衣藻在TAP液體培養(yǎng)基中于25 ℃左右，以光/暗(12 h/12 h)周期進(jìn)行光照培養(yǎng)。萊茵衣藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD750=0.6)時(shí)收集藻體，冰浴10 min，然后加入10 % Tween-20(1∶2 000v/v)。4 ℃下800 g離心5 min。去上清，將沉淀重新懸浮于含20 mM甘露醇與20 mM山梨醇TAP液體培養(yǎng)基中，重新培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取250 μL萊茵衣藻懸浮細(xì)胞于無(wú)菌離心管中，加入環(huán)形質(zhì)粒(終質(zhì)量濃度10 μg/mL藻懸浮細(xì)胞)、鮭魚(yú)精DNA(終質(zhì)量濃度200 μg/mL)。混勻，冰浴10 min。之后加入到無(wú)菌的電轉(zhuǎn)杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電壓為1 600 V/cm，脈沖時(shí)間為1 ms。電擊結(jié)束后，加入到新的無(wú)菌離心管中，培養(yǎng)于1 mL TAP非選擇培養(yǎng)基中，25 ℃水浴恢復(fù)培養(yǎng)5 min。之后在25 ℃左右、12 h/12 h的光/暗周期條件下進(jìn)行光照培養(yǎng)48 h。取萊茵衣藻懸液涂布于TAP固體培養(yǎng)基上(含5 μg/mL Par)，進(jìn)行光照培養(yǎng)，7 d見(jiàn)菌落。挑取單克隆于TAP液體培養(yǎng)基中做2次篩選。

1.2.5 萊茵衣藻總DNA提取 利用CTAB法提取植物基因組DNA：收集0.1～0.2 g新鮮藻體，置于預(yù)冷的研缽中，加液氮研磨成細(xì)粉。將細(xì)粉加入到65 ℃預(yù)熱的3 mL 2 % CTAB提取緩沖液(1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，2 % CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)中，輕輕混勻，65 ℃保溫30 min。待冷卻至室溫后離心，吸取上清至一新的離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕混勻后，室溫靜置10 min，10 000 r/m離心10 min。重復(fù)上一步2～3次。將上清轉(zhuǎn)入另一干凈離心管中，加入2/3體積的異丙醇，輕緩地顛倒混勻，-40 ℃放置10 min后，10 000 r/min離心10 min。棄上清，加入1 mL 70 %乙醇將沉淀轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，洗滌2～3次。沉淀室溫下放置10 min，微干后，溶于500～700 μL ddH2O中。加入等體積的氯仿/異戊醇抽提1～3次。上清液加入1/5體積的1.4 mol/L NaCl，混勻后，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20 ℃放置30 min后，12 000 r/min離心10 min。棄上清，沉淀用70 %乙醇洗滌2～3次，待其自然干燥后，溶于50～100 μL ddH2O中。取2 μL的 DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6 萊茵衣藻總RNA提取 參照奧萊博植物提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行萊茵衣藻總RNA的提取。

1.2.7 反轉(zhuǎn)錄，cDNA第一條鏈合成 提取的總RNA用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript First-Strand cDNA Synthesis Supermix，將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。

1.2.8 目的片段的獲取 以上述經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得來(lái)的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以全式金高保真Trans StartTMFast Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像儀中觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板篩選結(jié)果

將電轉(zhuǎn)化后的2種衣藻分別涂布于含有5 μg/mL巴龍霉素的TAP培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)7 d后，發(fā)現(xiàn)2種類型的衣藻均能夠正常生長(zhǎng)(圖1-A，B)。

圖1 WT 4CL-3a-STS轉(zhuǎn)化結(jié)果(A)和CC4254CL-3a-STS轉(zhuǎn)化結(jié)果(B)Fig.1 WT 4CL-3a-STS transformation results(A)and CC425 4CL-3a-STS transformation results(B)

2.2 轉(zhuǎn)化率分析

液體分別培養(yǎng)未轉(zhuǎn)化和已轉(zhuǎn)化的野生型衣藻和突變型衣藻至OD750=0.6，稀釋1 000倍，涂布于固體TAP培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后觀察并進(jìn)行單藻落計(jì)數(shù)(表1)。

由表1數(shù)據(jù)可得野生型衣藻轉(zhuǎn)化率為11.07 %，突變型衣藻轉(zhuǎn)化率為49.67 %，突變型衣藻轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)高于野生型衣藻的轉(zhuǎn)化率，可以推測(cè)野生型衣藻不易轉(zhuǎn)化是因?yàn)楹屑?xì)胞壁。在電轉(zhuǎn)化時(shí)細(xì)胞壁不容易被電穿，而突變型因?yàn)槿鄙偌?xì)胞壁電轉(zhuǎn)化更加容易，從而使得轉(zhuǎn)化率更高。

表1 萊茵衣藻單藻落數(shù)Tab.1 Number of single Chlamydomonas reinhardtii

2.3 鏡檢結(jié)果

2.3.1 衣藻野生型與突變體在明場(chǎng)與熒光下鏡檢情況 從平板上挑取衣藻野生型(WT)以及突變體(CC425)萊茵衣藻，制片后于同種狀態(tài)下拍照記錄在明場(chǎng)及熒光下觀察結(jié)果。結(jié)果表明，衣藻在明場(chǎng)下呈現(xiàn)為綠色，在熒光下整體呈現(xiàn)為紅色(圖2- A，B)。

圖2 衣藻野生型(A)和突變體(B)在明場(chǎng)(左)和熒光(右)下鏡檢結(jié)果Fig.2 Microscopic observation of Chlamydomonas(A) and mutant(B)in the bright field (left) and fluorescence (right)

2.3.2 衣藻野生型與突變體GFP表達(dá)情況的鏡檢 從平板上挑取轉(zhuǎn)化GFP基因的WT和CC425衣藻，制片后在同種狀態(tài)下拍照記錄明場(chǎng)及熒光下的觀察結(jié)果。結(jié)果(圖3-A，B)表明，在明場(chǎng)下衣藻整體呈現(xiàn)綠色，而在熒光下整體呈現(xiàn)紅色，且在紅色中存在熒光點(diǎn)，說(shuō)明GFP基因可能在衣藻中成功表達(dá)。

箭頭所指為綠色熒光蛋白圖3 轉(zhuǎn)化GFP基因的衣藻突變體(A)和野生型(B)明場(chǎng)下及熒光下鏡檢結(jié)果Note：The arrows refer to GFPFig.3 Microscopic observation of Chlamydomonas GFP transformation(B) and mutant GFP transformation (A) in the bright field (left) and fluorescence (right)

2.4 轉(zhuǎn)化藻株基因組檢測(cè)

從上述2種轉(zhuǎn)化藻株中提取基因組DNA，用4CL-3a-STS的引物擴(kuò)增目的片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出目標(biāo)條帶(圖4)，初步證明目的基因4CL-3a-STS已經(jīng)整合到萊茵衣藻基因組中。

M：DM 15000 DNA標(biāo)記；1，質(zhì)粒；2，載體；3，WT轉(zhuǎn)化株；4，WT；5，CC425轉(zhuǎn)化株；6，CC425圖4 轉(zhuǎn)化藻株目的基因片段的PCR檢測(cè)Note：M, 15000 DNA Marker; 1, plasmid; 2, vector; 3, transgenic WT; 4,WT; 5, transgenic CC425; 6, CC425Fig.4 DNAgel electrophoresis of 4CL-3a-STS gene amplified from genome of Chlamydomonas strains

2.5 轉(zhuǎn)化藻株轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果

從上述兩種轉(zhuǎn)化藻株中提取基因組RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用4CL-3a-STS的引物擴(kuò)增目標(biāo)片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出目標(biāo)條帶(圖5、6)，初步證明目標(biāo)基因4CL-3a-STS在萊茵衣藻中有表達(dá)。

M，DM 5000標(biāo)記；1，CC425；2，CC425轉(zhuǎn)化藻株圖5 CC425轉(zhuǎn)化藻株RT-PCR的凝膠電泳Note：M, DM 5000 Maker; 1, CC425; 2, CC425 transformantFig.5 RT-PCR gel electrophoresis of 4CL-3a-STSgene in CC425 transformant

M，DM 5000標(biāo)記；1，WT；2，WT轉(zhuǎn)化藻株圖6 WT轉(zhuǎn)化藻株RT-PCR的凝膠電泳Note：M, DM 5000 Marker; 1, WT; 2, WT transformantFig.6 RT-PCR gel electrophoresis of 4CL-3a-STS gene in WT transformant

3 討 論

3.1 轉(zhuǎn)化條件分析

3.1.1 最佳電擊電壓的條件 由于在衣藻進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)電擊電壓對(duì)于轉(zhuǎn)化率存在很大的影響，為了得到較好的轉(zhuǎn)化結(jié)果，將電壓由低到高設(shè)置成3個(gè)梯度，分別為600、1 200、1 800 V/cm。結(jié)果表明，在600及1 200 V/cm時(shí)兩種衣藻均能夠正常生長(zhǎng)，但在鏡檢下未發(fā)現(xiàn)熒光現(xiàn)象，表明這兩種電壓對(duì)衣藻造成的傷害較小，但不足以轉(zhuǎn)入外源基因。當(dāng)電壓升高至1 800 V/cm，衣藻可以正常生長(zhǎng)，并且成功在鏡檢下發(fā)現(xiàn)了綠色熒光，表明當(dāng)電壓為1 800 V/cm適用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

3.1.2 最佳固體培養(yǎng)基 由于本試驗(yàn)所用的表達(dá)載體pChalic-2ATG帶有aphVIII抗性基因，為了篩選出最佳抗性濃度。將衣藻兩種株系WT和CC425分別涂布于含有0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 μg/mL巴龍霉素的TAP培養(yǎng)基上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度提高至0.4 μg/mL時(shí)衣藻可以正常生長(zhǎng)，但當(dāng)濃度超過(guò)0.5 μg/mL時(shí)便全部死亡。表明衣藻對(duì)巴龍霉素也具有一定的抵抗能力，但巴龍霉素濃度值不能超過(guò)0.4 μg/mL。

將轉(zhuǎn)化后的衣藻涂布于含有3、4、4.5、5、5.5、6、6.5 μg/mL巴龍霉素的TAP培養(yǎng)基上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗生素為5 μg/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化后的衣藻仍可以正常生長(zhǎng)，但超過(guò)5.5 μg/mL時(shí)便表現(xiàn)為全部死亡。

3.1.3 最佳液體培養(yǎng)基抗生素濃度 將衣藻兩種株系WT和CC425分別加入含有0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1 μg/mL巴龍霉素的TAP培養(yǎng)基中。發(fā)現(xiàn)當(dāng)提高至0.01 μg/mL時(shí)衣藻可以正常生長(zhǎng)，但當(dāng)超過(guò)0.02 μg/mL時(shí)便全部死亡。表明衣藻對(duì)于巴龍霉素基本無(wú)抵抗能力。

挑取轉(zhuǎn)化后的單藻落于含有0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL 的巴龍霉素液體培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)液體培養(yǎng)基抗生素為1.5 μg/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化子仍可以生長(zhǎng)，但超過(guò)2.0 μg/mL時(shí)，萊茵衣藻全部死亡。

3.2 結(jié)論與展望

研究表明，電擊方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，適宜脈沖電壓為1 800 V/cm，此時(shí)衣藻野生型轉(zhuǎn)化率為11.07 %，細(xì)胞壁缺失型轉(zhuǎn)化率為49.67 %。轉(zhuǎn)基因抗生素篩選濃度為：固體培養(yǎng)基為5 μg/mL巴龍霉素，液體培養(yǎng)基為1.5 μg/mL巴龍霉素。

以往應(yīng)用基因工程和分子生物學(xué)方法都是利用微生物[10-12]或高等植物作為“生物反應(yīng)器”[13-14]。利用微生物成本高，獲得新遺傳性狀不穩(wěn)定，在正常自然條件下不易于生產(chǎn)與管理；高等植物成長(zhǎng)緩慢[15]。而萊茵衣藻可以避免以上的種種不足之處，它細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)繁殖迅速，易于培養(yǎng)，遺傳穩(wěn)定。因此，可以作為一種非常優(yōu)秀的生物反應(yīng)器，具有廣闊的應(yīng)用前景。