融合蛋白基因與抗體基因電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的條件摸索優(yōu)化

鄧曉芬 楊曉佳 易天紅 馮英 柯瀟 賴維莉

（成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品技術(shù)中心，成都 610036）

近年來，全球藥物研發(fā)的重心正在從小分子化藥向生物大分子藥物轉(zhuǎn)移，比如抗體、疫苗、激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、凝血因子和酶等，其中大部分為蛋白類藥物。由于多數(shù)蛋白類藥物分子量較小，半衰期短，為了延長(zhǎng)藥物的半衰期，蛋白融合技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生［1］。融合蛋白藥物是利用基因工程技術(shù)將某種具有生物學(xué)活性的功能蛋白分子與其他天然蛋白融合而產(chǎn)生的新型蛋白類藥物。與傳統(tǒng)的蛋白類藥物相比，融合蛋白藥物具有雙功能性［2］，既提高了功能蛋白的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)在體內(nèi)的代謝時(shí)間，又融合多個(gè)功能片段，形成高效靶向藥物。

繼重組蛋白藥物之后，重組抗體藥物引領(lǐng)了第2次生物醫(yī)藥產(chǎn)品浪潮，是今后若干年新藥研發(fā)的主要方向［3］。重組抗體是指利用重組DNA技術(shù)或是基因突變的方法改造某種抗體基因的編碼序列，使之產(chǎn)生出自然界中原本不存在的抗體蛋白分子［4］。重組抗體類藥物從組成上分為兩類，一類是抗體本身，而另一類是由抗體本身與治療藥物（如放射性核素，毒素等）結(jié)合構(gòu)成。

隨著生物藥物的發(fā)展，各種重組蛋白表達(dá)平臺(tái)也在發(fā)展，其中CHO細(xì)胞是表達(dá)重組蛋白（特別是融合蛋白和基因工程抗體）最常用的宿主之一［5-6］，而重組蛋白基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)，最關(guān)鍵的步驟便是基因的轉(zhuǎn)染。目前常用的轉(zhuǎn)染方法主要有電轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法等［7］。電轉(zhuǎn)染法相比其他轉(zhuǎn)染技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好和轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)，電轉(zhuǎn)染幾乎適用于所有細(xì)胞，但是不同的電轉(zhuǎn)染條件，會(huì)導(dǎo)致外源基因的轉(zhuǎn)染效率不同，即便在最優(yōu)條件下轉(zhuǎn)染相同細(xì)胞，不同的外源基因，轉(zhuǎn)染效率也會(huì)有所差別。本研究旨在摸索編碼融合蛋白和抗體的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)染條件，并對(duì)比在最優(yōu)電轉(zhuǎn)條件下兩分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果，為后續(xù)電轉(zhuǎn)染重組融合蛋白和重組抗體分子提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞 抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體融合蛋白表達(dá)載體pCMVi-VEGFR（由VEGFR1中的免疫球蛋白樣區(qū)域2和VEGFR2中的免疫球蛋白樣區(qū)域3，與人免疫球蛋白 Fc片段經(jīng)過融合而成），抗腫瘤壞死因子-α抗體表達(dá)載體pCMVi-TNF-α由成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司構(gòu)建并保存。CHO-S細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)Life TechnologyTM公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，限制性內(nèi)切酶FspⅠ購(gòu)自美國(guó)NEB公司，細(xì)胞培養(yǎng)基CD FortiCHO、Anticlumping agent、L-Glutamine均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，電轉(zhuǎn)儀Amaxa Nucleofector-II及試劑盒Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V購(gòu)自瑞士Lonza公司，紫外分光光度計(jì)Nanovue購(gòu)自美國(guó)GE公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Vi-cell購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，Octet Qke Refurb檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Pall公司，CloneMedia-CHO、高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司，CO2培養(yǎng)箱Forma371購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，細(xì)胞培養(yǎng)搖床ISF1-X購(gòu)自瑞士科耐公司。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的提取及線性化 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，按照去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒說明書的方法提取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒的線性化，37℃過夜酶切后回收質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA的線性化程度，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒DNA濃度后于-20℃保存待用。

1.2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 細(xì)胞用125 mL搖瓶，于120 r/min，36.5℃，5% CO2搖床培養(yǎng)，每2-3 d進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×105vc/mL傳代，培養(yǎng)體積為30 mL，細(xì)胞傳代培養(yǎng)基配制：1 L CD FortiCHO培養(yǎng)基加入40 mL L-Glutamin 和 10 mL Anti-clumping agent，4℃保存，使用前室溫預(yù)熱。

1.2.3 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)條件的摸索 將線性化的重組質(zhì)粒進(jìn)行以下電轉(zhuǎn)染條件的摸索：電轉(zhuǎn)染程序、質(zhì)粒用量和細(xì)胞用量，具體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，首先在細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔，質(zhì)粒用量為10 μg/孔的前提下，摸索并確定最佳的電轉(zhuǎn)染程序（U-023、U-024、U-030），接著利用最佳的電轉(zhuǎn)染程序，在細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔的前提下，摸索并確定電轉(zhuǎn)最佳的質(zhì)粒用量（5、10、15、20 μg/孔），最后在最佳的電轉(zhuǎn)染程序和最佳的質(zhì)粒用量前提下，摸索并確定電轉(zhuǎn)最佳的細(xì)胞用量（1×107、1.5×107、2×107個(gè)/孔）。電轉(zhuǎn)染前，6孔板中各加入2.5 mL細(xì)胞傳代培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱；取CHO-S細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算使用的細(xì)胞體積；電轉(zhuǎn)染按Amaxa Cell line Nucleofector kit V 轉(zhuǎn)染試劑盒操作程序進(jìn)行；電轉(zhuǎn)染后，6孔板置于36.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，48 h后取0.5 mL細(xì)胞液檢測(cè)細(xì)胞活率和活細(xì)胞密度，另取0.5 mL細(xì)胞液1000 r/min離心5 min，上清用Octet Qke Refurb檢測(cè)儀檢測(cè)蛋白表達(dá)量，綜合細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)量判斷最佳電轉(zhuǎn)染條件，并最終對(duì)比融合蛋白與抗體表達(dá)質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)效果。

1.2.4 轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè) 采用高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix進(jìn)行轉(zhuǎn)染后重組細(xì)胞陽(yáng)性克隆數(shù)的統(tǒng)計(jì)。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到最佳密度5000 cells/mL；已融化的半固體培養(yǎng)基CloneMedia中加入其它成分，配成100 mL體積：90 mL CloneMedia+7 mL水+1 mL CloneDetect+2 mL Clone XL Reagent；將稀釋好的細(xì)胞液加入到配好的CloneMedia中，混勻后接種6孔板，2 mL/孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后，觀察每個(gè)孔長(zhǎng)出的克隆數(shù)，間接判斷細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

表 1 電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒提取及線性化結(jié)果

質(zhì)粒按照去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒方法提取，得到的質(zhì)粒濃度和純度均較高，見表2，用限制性內(nèi)切酶FspⅠ酶切后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的線性化程度，見圖1，結(jié)果顯示質(zhì)粒線性化成功，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2.2 電轉(zhuǎn)染條件摸索試驗(yàn)結(jié)果

將編碼融合蛋白和抗體的重組質(zhì)粒分子線性化后，轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞，分別對(duì)兩種分子的電轉(zhuǎn)程序、質(zhì)粒用量和細(xì)胞用量進(jìn)行摸索。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)其活率、密度，Octet Qke Refurb檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞的蛋白表達(dá)量，通過對(duì)比細(xì)胞的狀態(tài)及蛋白表達(dá)量來確定最佳的轉(zhuǎn)染條件。融合蛋白重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索結(jié)果見圖2。

表2 重組表達(dá)質(zhì)粒濃度及純度

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化程度

采用不同的電轉(zhuǎn)染程序（U-023、U-024、U-030）電轉(zhuǎn)CHO-S細(xì)胞，48 h后檢測(cè)細(xì)胞的活率（2-A）、細(xì)胞的密度（2-B）及細(xì)胞的蛋白表達(dá)量（2-C），結(jié)果發(fā)現(xiàn)U-030程序下細(xì)胞的密度雖然最低，但與其他電轉(zhuǎn)程序下的細(xì)胞密度相比，差異并不是特別明顯，且該細(xì)胞的蛋白表達(dá)量最高，因此確定最佳電轉(zhuǎn)染程序?yàn)閁-030；同理對(duì)電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的用量進(jìn)行摸索（2-D-F），確定最佳質(zhì)粒用量為20 μg/孔；對(duì)電轉(zhuǎn)染細(xì)胞的用量進(jìn)行摸索（2-G-I），確定最佳的細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔，最終確定該分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)程序?yàn)閁-030，最佳質(zhì)粒用量為20 μg/孔，最佳細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔?？贵w重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索結(jié)果見圖3，其中包括對(duì)電轉(zhuǎn)程序的摸索結(jié)果（3-A-C）、質(zhì)粒用量的摸索結(jié)果（3-D-F）及細(xì)胞用量的摸索結(jié)果（3-G-I），最終確定該分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)程序?yàn)閁-024，最佳質(zhì)粒用量為15 μg/孔，最佳細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔，兩分子的最佳轉(zhuǎn)染條件匯總見表3。

表3 融合蛋白重組質(zhì)粒和抗體重組質(zhì)粒的最佳電轉(zhuǎn)條件匯總

圖2 融合蛋白重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 融合蛋白重組質(zhì)粒和抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)CHO-S細(xì)胞的效果對(duì)比

根據(jù)電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩個(gè)重組質(zhì)粒均采用最佳條件電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞，48 h后對(duì)細(xì)胞的活率、細(xì)胞的密度及蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4。電轉(zhuǎn)后兩者的細(xì)胞活率（4-A）差異不大，抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的密度稍高于融合蛋白重組質(zhì)粒（4-B），且細(xì)胞的蛋白表達(dá)量也更高（4-C），證明抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果略優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒。

2.4 半固體培養(yǎng)間接檢測(cè)重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率

將采用最佳條件電轉(zhuǎn)染的CHO-S細(xì)胞48 h后進(jìn)行半固體培養(yǎng)基接種，培養(yǎng)一段時(shí)間后采用高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix進(jìn)行熒光成像，檢測(cè)兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的陽(yáng)性克隆數(shù)。結(jié)果如圖5，表達(dá)抗體的重組細(xì)胞形成的陽(yáng)性克隆個(gè)數(shù)多于融合蛋白重組細(xì)胞（圖5-A），且根據(jù)平均外部熒光強(qiáng)度判斷，抗體重組細(xì)胞陽(yáng)性克隆的熒光強(qiáng)度高于融合蛋白重組細(xì)胞（圖5-B、5-C），與2.3的結(jié)果趨勢(shì)一致，再一次證明了抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒。

圖 3 抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 融合蛋白重組質(zhì)粒與抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果對(duì)比

3 討論

目的基因能否進(jìn)行表達(dá)，取決于表達(dá)質(zhì)粒能否成功轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染作為重組生產(chǎn)用細(xì)胞株篩選的第一步，也是最重要的一步。目前常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法主要有物理方法、化學(xué)方法及生物方法［8］，電轉(zhuǎn)染作為物理轉(zhuǎn)染方法應(yīng)用非常廣泛，幾乎適用于所有細(xì)胞類型。但是不同的細(xì)胞系有不同的最佳轉(zhuǎn)染條件，即使是相同的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染入不同的外源基因，也會(huì)有不同的最佳條件，況且不同的實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)染效率也有所不同［9］，因此需對(duì)不同的基因，細(xì)胞類型，用量，轉(zhuǎn)染條件等因素進(jìn)行摸索和優(yōu)化。

圖5 融合蛋白與抗體重組細(xì)胞半固體陽(yáng)性克隆數(shù)及熒光強(qiáng)度對(duì)比

本研究利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的條件，對(duì)融合蛋白重組質(zhì)粒和抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞進(jìn)行了簡(jiǎn)單的摸索優(yōu)化，主要從電轉(zhuǎn)染程序、質(zhì)粒用量及細(xì)胞用量三方面入手，通過對(duì)比轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的活率、密度及蛋白表達(dá)量的差異，最終確定細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)條件。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染相同的CHO-S細(xì)胞，融合蛋白分子和抗體分子的最佳轉(zhuǎn)染條件均不同，且抗體分子的蛋白表達(dá)效果略優(yōu)于融合蛋白分子。

利用摸索好的最佳轉(zhuǎn)染條件，對(duì)CHO-S細(xì)胞電轉(zhuǎn)后進(jìn)行半固體接種，利用高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix對(duì)轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性克隆細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒，這也為以后抗體或融合蛋白分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞，獲得最優(yōu)的蛋白表達(dá)提供了一定的數(shù)據(jù)支持，也提示對(duì)于其他類型的細(xì)胞，或者其他重組質(zhì)粒，同樣需要設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)對(duì)最佳轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行摸索，進(jìn)而得到最優(yōu)的轉(zhuǎn)染效果。

4 結(jié)論

融合蛋白重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳條件為：電轉(zhuǎn)程序U-030，質(zhì)粒用量為20 μg/孔，細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔；抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳條件為：電轉(zhuǎn)程序U-024，質(zhì)粒用量為15 μg/孔，細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔，且抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒。