范磊 戴冬洋，2 熊安平 盛云燕 于明珠 秦瑛聰

（1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319；2. 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，石河子 832003）

甜瓜（Cucuumis meloL.）是葫蘆科重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，性別分化類型豐富，主要受兩個(gè)基因控制——A基因和G基因［1，2］。G基因（WIP1）抑制心皮發(fā)育導(dǎo)致雄花發(fā)育。研究表明，CmACS7在甜瓜完全花早期發(fā)育過程中引起雄蕊退化，產(chǎn)生雌雄異花同株和全雌系［2］。其中全雌系植株的產(chǎn)生是由于一個(gè)hAT轉(zhuǎn)錄因子家族的插入而引起的［1］。甜瓜性別分化是甜瓜單性材料育種的重要理論依據(jù)，而甜瓜單性花育種是培育新品種的重要目標(biāo)之一。但是，通過傳統(tǒng)表型選擇方法篩選單性甜瓜材料，不僅要求豐富的經(jīng)驗(yàn)而且耗費(fèi)大量的人力、物力，而且甜瓜性別分化容易受多條件限制，培育優(yōu)良單性品種需花費(fèi)7-8年甚至十幾年時(shí)間。因此，提高選擇的效率和減少育種過程中的盲目性是育種工作的關(guān)鍵。

分子標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）可以從分子水平快速準(zhǔn)確地分析個(gè)體的遺傳組成。前人甜瓜QTL主效基因的定位和克隆進(jìn)行了較多的研究［5-8］，但是應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助選擇育種過程中的標(biāo)記較少。甜瓜性別分子標(biāo)記研究較多［9-12］，主要集中在控制雄全同株Cm-Acs-7（A基因）基因位點(diǎn)，張喬玲等［10］甜瓜純合單性花材料與兩性花材料在CmACS-7（A）基因缺失位點(diǎn)開發(fā)出了InDel-1標(biāo)記，用于甜瓜性別早期選擇。李鳳梅等［11］建立了甜瓜單性花Cm-ACS7分子標(biāo)記體系。前期研究主要集中在單性花基因Cm-ACS7上，對(duì)于共同篩選A、G基因的報(bào)道相對(duì)較少。

本研究利用已經(jīng)克隆的甜瓜2個(gè)性別基因，設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，在苗期，利用A和G基因鑒定甜瓜的性別類型，可以大大縮短選擇育種的年限，加速分子聚合育種的進(jìn)程，為甜瓜其他性狀的分子標(biāo)記輔助育種提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料

甜瓜母本為WI998，厚皮網(wǎng)紋甜瓜，全雌系；父本為TopMark，厚皮網(wǎng)紋甜瓜，雄全同株，二者均來源于美國威斯康星大學(xué)瓜類遺傳育種研究室。以單粒傳的方式獲得F8重組自交系群體，選擇47個(gè)家系（以WT命名，按照順序編號(hào)，每個(gè)家系種植12個(gè)單株）用于分子標(biāo)記輔助選擇，同時(shí)選擇14份甜瓜材料為驗(yàn)證材料（表1）。

表1 供試甜瓜材料

1.2 方法

1.2.1 分子標(biāo)記 選擇甜瓜兩片真葉展開時(shí)的新鮮葉片組織，利用CTAB法提取DNA，DNA濃度為15-50 ng/L。 根 據(jù) NCBI genbank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 公 布 的 甜 瓜 A 基 因（CmACS-7，ID：103492295）和G基因（WIP1+Gyno-hAT，ID：103491671）序列設(shè)計(jì)引物，CmACS-7轉(zhuǎn)化Caps標(biāo)記，命名為Cmacs7，引物序列為F：5′-CAGTGGCACCAGCAGTTA-3′；R ：5′-GGAAAGCGTATGATGAAG-3′，利用AluⅠ對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行酶切。G基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)2個(gè)引物，區(qū)分是否含有Gyno-hAT插入位點(diǎn)的引物 Cmhat：F ：5′-ATGGCAGACAGATTGTTATTAGTG-3′；R ：5′-GAGTAGAAGGTACTCCAAATGAATGGC-3′；區(qū)分G（g）位點(diǎn)雜合與純合性引物Cms，F(xiàn) ：5′-CGGTTCGGTCCAGTAACATT-3′；R ：5′-AGGGGGAAGAAAAAGGGATT-3′。

PCR反應(yīng)體系采用10×擴(kuò)增緩沖液1 μL（MgCl2+）、dNTPs（1 mmol/L）0.2 μL、引物（5 pmol/L）2 μL、模板 DNA（15-20 ng/μL）1 μL、Taq DNA 聚合酶（1 U/μL）0.1 μL，ddH2O 補(bǔ)至 10 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 30 s；94℃ 30 s，50-68℃30 s，72℃ 40 s，25個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，拍照。Cmacs-7擴(kuò)增產(chǎn)物在37℃下酶切3 h。

1.2.2 田間性狀調(diào)查 2013年、2014年及2018年分別種植驗(yàn)證材料及重組自交系群體，調(diào)查單株開花類型，記錄植株性別：雌雄異花同株（雄花和雌花）、完全花植株（只著生完全花）、全雌株（只著生雌花）和雄全同株（雄花和完全花）；2013年及2014年調(diào)查甜瓜重組自交系群體家系每個(gè)單株主蔓30節(jié)前所有雌花、雄花及完全花的開花率，驗(yàn)證性別表現(xiàn)；2018年調(diào)查植株開花類型；對(duì)DNA分子標(biāo)記檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 CmACS-7基因位點(diǎn)檢測結(jié)果分析

利用CmACS-7標(biāo)記對(duì)親本、重組自交系群體及驗(yàn)證材料進(jìn)行分析，所有供試材料在 383 bp產(chǎn)生一個(gè)位點(diǎn)，經(jīng)ALUⅠ酶切3 h后，酶切產(chǎn)物分為3種類型（圖1）。當(dāng)PCR產(chǎn)物在383 bp被全部酶切，該位點(diǎn)所顯示基因型為aa；當(dāng)PCR產(chǎn)物不能被酶切時(shí)，該位點(diǎn)代表AA基因型，當(dāng)酶切位點(diǎn)和PCR產(chǎn)物位點(diǎn)均有擴(kuò)增條帶時(shí)，代表基因型為Aa，呈雜合狀態(tài)。

圖1 甜瓜CmACS-7擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

2.2 重組自交系群體G基因位點(diǎn)的檢測

利用NCBI公布的Gyno-hat序列與WIP1序列，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，以期區(qū)分純合位點(diǎn)與雜合位點(diǎn)，基因結(jié)構(gòu)示意圖與引物設(shè)計(jì)原則如圖2所示。由于插入3 kbGYno-hat序列，Cmhat引物擴(kuò)增條帶過大無法檢測到，因此當(dāng)Cmhat引物產(chǎn)生擴(kuò)增條帶（197 bp）時(shí)，說明該材料基因型為G，而該位點(diǎn)無產(chǎn)物則基因型為g；在gyno-hat共有序列WIP1連接處設(shè)計(jì)引物Cms，擴(kuò)增產(chǎn)物在184 bp有條帶時(shí)說明該位點(diǎn)為g，如果無擴(kuò)增產(chǎn)物則為G。利用2對(duì)基因共同擴(kuò)增待測DNA，即可檢測G基因位點(diǎn)基因型。

2.3 分子標(biāo)記檢測的準(zhǔn)確性

對(duì)甜瓜重組自交系群體的47個(gè)家系、3個(gè)F1及14個(gè)純合品系進(jìn)行分子標(biāo)記的檢測（表2）。No.3-2-2和WI846為雌雄異花同株，與3年的田間鑒定結(jié)果相吻合，而且基因型純合。WI998為全雌系，TopMark為雄全同株，與3年的田間檢測結(jié)果吻合，基因型純合。3個(gè)雜交組合F1代，分子檢測結(jié)果和田間觀察結(jié)果相同，基因型為雜合型。

對(duì)研究材料開展田間表型鑒定，以單株開花雌花、雄花及完全花的比率確定性別類型，61份材料中，59份材料基因型和表現(xiàn)型結(jié)果相互吻合，WT7-2為全雌株（表2）。2013年田間檢測為全雌株，2014年和2018年田間檢測為雌雄異花同株；WT113基因型鑒定為雄全同株，2013年表型鑒定為雄全同株，2014年和2018年鑒定為雌雄異花同株；田間檢測47個(gè)甜瓜重組自交系中19個(gè)家系為雌雄異花同株，4個(gè)家系為全雌株，24個(gè)家系雄全同株，1個(gè)家系株完全花株。分子標(biāo)記選擇效率為96.3%。結(jié)果表明，通過這兩個(gè)分子標(biāo)記能夠分別鑒定基因純合型和雜合型，并且能較為準(zhǔn)確地鑒定甜瓜性別類型。

3 討論

DNA分子標(biāo)記輔助選擇是通過利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)進(jìn)行間接的選擇，基因克隆技術(shù)和分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，使目的性狀的選擇越來越準(zhǔn)確。通過分子標(biāo)記的早期選擇可以克服隱性基因識(shí)別難度的問題，并且能夠區(qū)別基因純合型及雜合型，從而提高育種效率，加速育種進(jìn)程［13-15］。通常情況下，分子標(biāo)記輔助選擇是根據(jù)QTL找到與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過標(biāo)記進(jìn)行篩選，瓜類作物一些重要的性狀主效QTL的已經(jīng)被報(bào)道［5，16］，這些瓜類性狀緊密連鎖的標(biāo)記可直接用于分子標(biāo)記輔助選擇。但是分子生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，即使與性狀連鎖距離小于1 cm，在連鎖區(qū)域包含很多候選基因，而基因間的互作可能影響對(duì)目標(biāo)性狀鑒定的準(zhǔn)確性。因此，通過獲得目的基因序列，設(shè)計(jì)引物，能夠更加直接有效地鑒定目的性狀。

圖2 Cmhat與Cms標(biāo)記檢測G位點(diǎn)結(jié)果

表2 甜瓜重組自交系群體植株與驗(yàn)證植株性別表達(dá)田間鑒定

續(xù)表

甜瓜性別基因的研究始終繞著甜瓜性別表達(dá)、甜瓜性別基因定位展開，直到2008年甜瓜性別基因A基因和G基因的克隆才為甜瓜性別類型的選擇提供了重要的理論依據(jù)［1-2］。本研究根據(jù)已經(jīng)克隆的A基因和G基因，設(shè)計(jì)引物，目的在于不僅能夠鑒定甜瓜性別，而且還能區(qū)分基因純合型及雜合型，可以直接用于甜瓜育種工作。本研究表明分子標(biāo)記能夠成功地鑒定甜瓜性別類型，而且雜合基因型也能夠準(zhǔn)確地鑒定。本研究中WT7-2和WT113基因型鑒定分別為全雌株和雄全同株，由于甜瓜的性別表現(xiàn)受到環(huán)境因素等多方面的影響，而且部分雌雄異花同株植株在花芽類型的開放順序也不盡相同（有的早期大量開放雌花，后期開放雄花；有的早期大量開放雄花，后期開雌花），可能是造成田間性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果不同的原因之一。

此外，本研究種植每個(gè)家系12個(gè)單株，統(tǒng)計(jì)平均值作為田間調(diào)查的依據(jù)對(duì)研究結(jié)果也存在一定影響。WT113分子基因型鑒定為雄全同株，2013年田間鑒定結(jié)果與分子鑒定結(jié)果相同，但是2014年和2018年田間表現(xiàn)均為雌雄異花同株，除了受到環(huán)境條件的影響之外，花器官發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)差異也是影響甜瓜性別表達(dá)的因素之一［19］。研究者曾經(jīng)對(duì)甜瓜不同性別轉(zhuǎn)錄組分析，挖掘甜瓜性別相關(guān)差異基因的研究中發(fā)現(xiàn)，花粉不育基因在雄全同株和雌雄異花同株中差異表達(dá)［20］，WT113田間性狀的變化及與分子鑒定結(jié)果的不同，也可能是通過環(huán)境變化誘導(dǎo)差異基因表達(dá)，形成不同植株類型。

4 結(jié)論

利用已發(fā)表的甜瓜性別基因序列設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，在甜瓜苗期鑒定雄全同株、全雌株、雌雄異花同株及完全花株，并且能夠區(qū)分鑒定基因雜合型位點(diǎn)。