生物法制備甲殼素/殼聚糖的研究進(jìn)展

王蒙 李瀾鵬 張全 彭紹忠 曹長(zhǎng)海

（中國(guó)石油化工股份有限公司 大連（撫順）石油化工研究院生物燃料及生物化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116045）

甲殼素（Chitin）是地球上數(shù)量?jī)H次于纖維素的第二大天然高分子多糖，廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、原生動(dòng)物、腔腸動(dòng)物及真菌和藻類(lèi)的細(xì)胞壁中。地球上每年甲殼素的生物合成量約為 100 億 t［1］。1811 年法國(guó)科學(xué)家 Braconnot［2］首次發(fā)現(xiàn)甲殼素，純態(tài)甲殼素為β-（1，4）-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡聚糖，由二糖重復(fù)單元通過(guò)β-（1，4）-D-糖苷鍵連接成為線型高聚物（圖1-a），其化學(xué)結(jié)構(gòu)和植物纖維素的結(jié)構(gòu)非常相似；天然甲殼素因分子鏈中部分乙酰基被脫除，因此可視為2-乙酰氨葡萄糖和2-氨基葡萄糖的共聚物（圖1-b）；進(jìn)一步脫去結(jié)構(gòu)中的乙?；统蔀槠渥顬橹匾拿撘阴；苌餁ぞ厶牵▓D1-c）。

甲殼素/殼聚糖因具有良好的生物可降解性、生物相容性、無(wú)毒性和抑菌性，可用于紡織印染、食品醫(yī)療、化工環(huán)保等高附加值領(lǐng)域［3-5］。例如，由殼聚糖制成的人造皮膚，因其良好的透氣性、滲出性、可抑菌止痛止癢等優(yōu)點(diǎn)，并能促進(jìn)皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)從而加快傷口愈合［6］，在臨床醫(yī)學(xué)上有著廣泛的應(yīng)用［7-8］；利用殼聚糖設(shè)計(jì)生產(chǎn)納米膠囊以實(shí)現(xiàn)微膠囊技術(shù)的應(yīng)用，在藥物輸送、生物制劑以及疫苗生產(chǎn)等方面都有潛在的應(yīng)用［9］。此外，由于甲殼素/殼聚糖分子中存在大量的活性官能團(tuán)（氨基、羥基），有利于進(jìn)一步對(duì)官能團(tuán)進(jìn)行修飾得到更加功能化的化合物，得到的衍生物在生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品等領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用［10］，殼聚糖衍生物作為疫苗佐劑可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原微生物的免疫應(yīng)答［11］。

隨著化石資源的日益減少，石油基合成高分子的降解性給生態(tài)環(huán)境造成的污染日益嚴(yán)重，開(kāi)發(fā)有潛力的再生資源成為世界各國(guó)的研究熱點(diǎn)，生產(chǎn)優(yōu)良品質(zhì)的甲殼素/殼聚糖成為開(kāi)發(fā)應(yīng)用這一材料重要的前提條件，為此本文對(duì)現(xiàn)有的甲殼素/殼聚糖的生物制備方法進(jìn)行總結(jié)評(píng)述。

1 甲殼素/殼聚糖的來(lái)源

甲殼素來(lái)源于節(jié)肢動(dòng)物和低等植物的真菌和藻類(lèi)，前者大量存在于海洋之中，以蝦、蟹產(chǎn)量最大，且易于富集，甲殼素含量也高，干重含量在14%-27%之間，極具提取利用價(jià)值。目前，工業(yè)上生產(chǎn)甲殼素的主要原料便源于此［12］。

圖1 純態(tài)甲殼素（a）、天然甲殼素（b）、殼聚糖（c）和纖維素分子結(jié)構(gòu)（d）

陸地上可以用于甲殼素原料的節(jié)肢動(dòng)物有蠶蛹、家蠅的幼蟲(chóng)蛹?xì)ず透黝?lèi)昆蟲(chóng)等。其中蠶蛹較為集中，其他則較為分散，收集困難，給工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)現(xiàn)帶來(lái)一定的困難。但也有研究在無(wú)菌條件下繁殖家蠅，以蛆蟲(chóng)為原料提取甲殼素［13-14］。以此種資源提甲殼素，雖然比例小，但原料集中，便于工業(yè)化生產(chǎn)，有著良好的發(fā)展前景。在自然界中，除少數(shù)真菌外，其他真菌均含有甲殼素和殼聚糖。甲殼素與殼聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要組成成分，例如，在子囊菌綱、擔(dān)子菌綱等真菌細(xì)胞壁中，甲殼素的含量占菌體干重的2%-42%。

2 甲殼素制備

在甲殼類(lèi)動(dòng)物中，甲殼素與蛋白質(zhì)，以及附著于蛋白質(zhì)上成殼的碳酸鈣組成復(fù)雜的網(wǎng)狀體系，甲殼素與蛋白之間的相互作用力較強(qiáng)，并且部分的蛋白質(zhì)還參與了多糖-蛋白復(fù)合物的形成；此外，在原料中還存在些許脂肪和以蝦青素為主的類(lèi)胡蘿卜素及其形成的酯。因此，生產(chǎn)甲殼素最主要的步驟是蛋白質(zhì)和CaCO3的脫除，同時(shí)，脂肪和色素在以上脫除過(guò)程中一并去除［15］。有些情況下，需要添加脫色步驟用于脫除色素以達(dá)到甲殼素的生產(chǎn)要求。

傳統(tǒng)生產(chǎn)甲殼素的方式是利用蝦蟹殼作為原料的酸堿法，可歸納為“三脫”。一是脫除蛋白質(zhì)，也是最為困難的一步，因?yàn)榧讱に睾偷鞍字g存在化學(xué)鍵的作用，脫蛋白試劑有NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、Ca（OH）2、Na2SO3、NaHSO3、Na3PO4和Na2S等，蛋白的脫除程度要具體對(duì)待，過(guò)度的脫蛋白會(huì)造成甲殼素的脫乙?；退?，相反，由于部分人群對(duì)甲殼類(lèi)動(dòng)物存在過(guò)敏的癥狀，所以蛋白存留會(huì)影響甲殼素在醫(yī)藥方面的應(yīng)用；二是脫除無(wú)機(jī)鹽，主要為CaCO3。脫鹽的主要方法為酸處理，脫鹽試劑有HCl、HNO3、H2SO4、CH3COOH、HCOOH等，最常用的是HCl。由于CaCO3易酸解，所以脫鹽過(guò)程相對(duì)容易完成。一般來(lái)講，提高溫度有利于酸對(duì)甲殼素基質(zhì)的浸透，提高脫鹽效率［16］，但同樣會(huì)帶來(lái)甲殼素的脫乙酰化和水解；三是脫除色素，目前，工業(yè)上甲殼素脫色主要通過(guò)日光照射和KMnO4氧化脫色的辦法。日光照射脫色時(shí)間長(zhǎng)，而且產(chǎn)物偏黃色。KMnO4脫色后需要加NaHSO3等還原劑進(jìn)行還原處理。另外，未反應(yīng)的KMnO4還會(huì)給環(huán)境造成壓力。雙氧水是工業(yè)上常用的氧化脫色劑，價(jià)格低廉且分解產(chǎn)物無(wú)污染，近年來(lái)雙氧水脫色的研究引起了人們的關(guān)注［17-18］。

傳統(tǒng)的酸堿法提取甲殼素存在很多缺陷：（1）使用了大量的酸堿，消耗能源的同時(shí)，環(huán)境污染嚴(yán)重；（2）甲殼素后續(xù)純化過(guò)程復(fù)雜，增加了生產(chǎn)成本；（3）造成甲殼素分子量及乙?；潭鹊慕档?，從而影響甲殼素產(chǎn)品品質(zhì)。雖然，科研工作者在此基礎(chǔ)上做了工藝上的改進(jìn)。例如，用相對(duì)溫和的EDTA、檸檬酸代替鹽酸用于CaCO3等無(wú)機(jī)鹽的脫除［19-20］，但是始終無(wú)法從根本上解決這些問(wèn)題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，為了解決酸堿法帶來(lái)的問(wèn)題，不同的生物處理技術(shù)被研究用于甲殼素的提取，如蛋白酶酶解、微生物發(fā)酵等［21-22］，另外，生物法與化學(xué)法相結(jié)合的處理手段也成為了研究的一個(gè)方向［23］。

2.1 酶法脫蛋白

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)許多蛋白酶，如堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等，其中以堿性蛋白酶居多，有利于從甲殼動(dòng)物外殼中將蛋白質(zhì)分離出來(lái)，可以用于甲殼素的提取，并且該方法具有條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)［24-26］，其作用原理是甲殼動(dòng)物外殼中存在的蛋白質(zhì)在蛋白酶的催化作用下與外殼分離，并且使分離過(guò)程中的去乙?；饔煤徒饩圩饔米钚』?。Antunes-Valcareggi等［27］發(fā)現(xiàn)青蟹廢料中添加3%（E/S）堿性蛋白酶ProteMax 750 L，在53℃，pH9條件下，作用120 min可以去除30%的蛋白質(zhì)。

Younes等［28］對(duì) 比 了 分 別 來(lái) 源 于Bacillus mojavensisA21、Bacillus subtilisA26、Bacillus.licheniformisNH1、Bacillus. licheniformisMP1、Vibrio metschnikoviiJ1及Aspergillus clavatusES1所產(chǎn)的堿性蛋白酶對(duì)于蝦殼蛋白的脫蛋白效率，研究發(fā)現(xiàn)相同條件下，其中來(lái)源于Bacillus mojavensisA21的蛋白酶脫蛋白效果最好，其蛋白質(zhì)脫除率約為76%，而來(lái)源于Bacillus. licheniformisNH1的蛋白酶的蛋白脫除率為65%，Aspergillus clavatusES1所產(chǎn)的蛋白酶的脫蛋白效率只有59%，可以看出雖然同屬于堿性蛋白酶，但來(lái)源不同的酶對(duì)同一種生物資源底物蛋白的脫蛋白效果依舊有明顯的差別。該研究進(jìn)一步考察了脫鹽后酶法脫蛋白的條件，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化了酶、底物的添加比例、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等反應(yīng)條件，源自Bacillus mojavensisA21的蛋白酶蛋白質(zhì)脫除率可進(jìn)一步提高到88%。另外，研究發(fā)現(xiàn)，同一種酶對(duì)于不同的生物資源的蛋白脫除率不盡相同，Hamdi等［29］從梭子蟹中提取了消化堿性蛋白粗酶，經(jīng)分析，該粗酶中含有至少五種不同的蛋白酶。在50℃，5 U/mg添加量下，對(duì)蝦殼作用3 h后，對(duì)藍(lán)蟹殼的蛋白脫除率為84.69%±0.65%，但對(duì)蝦殼中蛋白脫除率達(dá)到了91.06%±1.40%。如產(chǎn)自于Pseudomonas aeruginosaK-187的蛋白酶對(duì)天然蝦殼的蛋白脫除率可到78%，對(duì)蝦蟹殼粉末的蛋白脫除率為72%，而對(duì)于酸處理過(guò)的蝦蟹殼粉末的蛋白脫除率只有45%［30］。上述結(jié)果說(shuō)明相同的蛋白酶對(duì)于不同的底物的脫蛋白效果不盡相同，同一底物經(jīng)不同的預(yù)處理過(guò)程后對(duì)蛋白酶的酶解作用也有明顯的影響，脫蛋白酶作為一種酶催化劑的一種，對(duì)底物具有高度的選擇性和特異性。

Carla等［31］對(duì)中試規(guī)模的化學(xué)法和酶法生產(chǎn)甲殼素的可持續(xù)性進(jìn)行了分析和評(píng)估，通過(guò)在三個(gè)可持續(xù)維度的評(píng)估和整合以獲得相對(duì)一致的比較基線，研究表明，由于酶法具有更加廣闊的研究領(lǐng)域，上升空間巨大，未來(lái)可以獲得顯著的優(yōu)勢(shì)。酶法是可以替代化學(xué)法來(lái)完成甲殼素的提取，尤其是在考慮到水回收利用的時(shí)候，這一優(yōu)勢(shì)更加明顯。

甲殼素生產(chǎn)過(guò)程中，酶催化作為新的蛋白質(zhì)脫除方法，具有很大的潛力。相對(duì)于化學(xué)法而言，（1）酶法脫蛋白質(zhì)的效率相對(duì)低，約5%-10%殘留蛋白質(zhì)與甲殼素結(jié)合在一起，還需要額外的添加NaOH，并在相對(duì)溫和的條件下進(jìn)行處理來(lái)提高甲殼素的純度及結(jié)構(gòu)；（2）在化學(xué)提取甲殼素的過(guò)程中，脫鹽和脫蛋白質(zhì)進(jìn)行的先后順序?qū)讱に氐淖罱K產(chǎn)量和質(zhì)量無(wú)明顯的影響，但是，在酶法提取甲殼素時(shí)，礦物質(zhì)的存在降低了蛋白酶的可及性，從而影響了蝦殼的脫蛋白效率，所以脫鹽的步驟應(yīng)該在酶法脫蛋白之前。

2.2 微生物發(fā)酵制備甲殼素

酶法脫蛋白提取甲殼素工藝雖然降低了堿所帶來(lái)的環(huán)境污染，減少了能耗，但是存在耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、脫蛋白不充分等缺點(diǎn)，更重要的是所需酶制劑生產(chǎn)及使用問(wèn)題亟待解決，這些都導(dǎo)致酶法提取甲殼素工藝成本較高，采用微生物發(fā)酵的提取工藝可以在一定程度上解決這一問(wèn)題。微生物發(fā)酵工藝即以蝦蟹殼的廢料為原料，利用微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中所產(chǎn)的有機(jī)酸將蝦、蟹等原料中的礦物質(zhì)溶解起到脫鹽的作用，所產(chǎn)“酵素”將蛋白質(zhì)水解達(dá)到除蛋白的目的。微生物菌種可以來(lái)源于蝦蟹殼等原料，也可以通過(guò)外加。蝦蟹殼廢料中的菌種為原始自帶菌種，活力較差，調(diào)控較為復(fù)雜，發(fā)酵效果相對(duì)較差，因此，微生物發(fā)酵一般采用外加菌種的方式進(jìn)行。Arbia等［32］對(duì)現(xiàn)有報(bào)道用于甲殼類(lèi)廢料發(fā)酵的微生物種類(lèi)進(jìn)行了總結(jié)，包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、片球菌屬（Pediococcus）、沙雷菌屬（Serratia）、黑曲霉（Aspergillus niger）等。根據(jù)微生物發(fā)酵過(guò)程中的作用方式不同，可以分為發(fā)酵脫除鹽［33］、發(fā)酵脫除蛋白質(zhì)［34］及發(fā)酵脫除鹽和蛋白質(zhì)［35］3種作用方式。此外，脫蛋白/鹽的效率與發(fā)酵原料、初始pH、發(fā)酵類(lèi)型和發(fā)酵時(shí)間等條件有關(guān)［36］。

Choorit等［37］利用響應(yīng)面法優(yōu)化了Pediococcussp L1/2發(fā)酵蝦頭脫鹽條件，結(jié)果表明，在37℃，糖濃度50 g/L，初始pH7.0，發(fā)酵36 h后脫鹽率最高達(dá)到83.47%。Ghorbel-Bellaaj等［38］評(píng)價(jià)了6種蛋白水解芽孢桿菌對(duì)蝦殼發(fā)酵脫蛋白的效果，6種芽孢桿菌分別為Bacillus pumilusA1、Bacillus mojavensisA21、Bacillus licheniformisRP1、Bacillus cereusSV1、Bacillus amyloliquefaciensAn6及Bacillus subtilisA26。結(jié)果顯示，6種芽孢桿菌均可以有效地脫除蝦殼中的蛋白質(zhì)，脫蛋白率在80%以上，但是只有不到67%的礦物被脫除；Zhang等［39］以蝦殼粉為原料，利用連續(xù)三步微生物發(fā)酵技術(shù)制備甲殼素（所用菌種為Serratia marcescensB742，Lactobacillus plantarumATCC 8014和Rhizopus japonicusM193），甲殼素產(chǎn)率為21.35%，回收率達(dá)74.67%。Neves等［33］發(fā)現(xiàn)Lactobacilus plantarum發(fā)酵對(duì)淡水蝦殼脫蛋白質(zhì)、脫鹽的效果更佳，在其最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵72 h后，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到99%，脫鹽率達(dá)到87%，有望替代傳統(tǒng)的化學(xué)法提取甲殼素。

為了進(jìn)一步提高發(fā)酵提取甲殼素的效率，充分發(fā)揮菌種的不同作用，實(shí)現(xiàn)最大限度的脫除蛋白質(zhì)及鈣鹽，共培養(yǎng)和分步連續(xù)培養(yǎng)的發(fā)酵方式被引入發(fā)酵提取甲殼素提取工藝中［40-41］。Duan等［42］考察了Streptococcus thermophiles、Lactobacillus acidophilus和Lactobacillus bulgaricus共培養(yǎng)體系對(duì)蝦殼中甲殼素的提取，8 h內(nèi)發(fā)酵體系的pH降低到4.25，pH最低可達(dá)3.22，相對(duì)乳酸含量為0.25 mol/L，此酸性環(huán)境促進(jìn)了鈣和蛋白的脫除，發(fā)酵168 h，脫鹽率和脫蛋白率分別為91.3%和97.7%，同時(shí)色素脫除率也達(dá)到了32.3%。Liu等［43］研究了產(chǎn)酶菌種Bacillus licheniformis21886和產(chǎn)酸菌種Gluconobacter oxydansDSM-2003不同培養(yǎng)方式下用于蝦殼廢料中甲殼素的提取。發(fā)酵方式分別為：（1）21886菌種和2003菌種同時(shí)共培養(yǎng)發(fā)酵96 h，添加5%葡萄糖；（2）21886菌種先培養(yǎng)發(fā)酵60 h，之后接種2003菌種，同時(shí)添加5%葡萄糖，繼續(xù)共培養(yǎng)發(fā)酵36 h；（3）2003菌種先培養(yǎng)發(fā)酵36 h，同時(shí)添加5%葡萄糖，之后接種21886菌種，繼續(xù)共培養(yǎng)60 h。研究發(fā)現(xiàn)，第二種培養(yǎng)方式對(duì)甲殼素的提取效率最佳，在共發(fā)酵中，以乳酸、甲/乙酸為主的8種有機(jī)酸的含量達(dá)到了16 g/L，是Gluconobacter oxydansDSM-2003單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)酸量的3倍多，發(fā)酵96 h后，脫鹽率達(dá)到了87%，脫蛋白率達(dá)到了93.5%，發(fā)酵體系中甲殼素的含量達(dá)到了90.8%。同時(shí)，也有專(zhuān)利公開(kāi)發(fā)酵生產(chǎn)甲殼素的方法，首先利用枯草芽孢桿菌和氧化葡萄糖桿菌協(xié)同作用加以葡萄糖來(lái)發(fā)酵蝦皮和蝦頭進(jìn)行脫鹽和脫蛋白質(zhì)，然后利用嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌共生體系發(fā)酵一周進(jìn)行脫鈣和脫色，得到相應(yīng)的甲殼素［44］。

微生物發(fā)酵法制備甲殼素具有條件溫和、能耗低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，但是現(xiàn)階段的研究基本都停留在實(shí)驗(yàn)室階段，距離最后的工業(yè)化生產(chǎn)階段還有很長(zhǎng)的距離。目前，菌種篩選、優(yōu)化發(fā)酵條件、組合不同發(fā)酵方式等方法雖然已經(jīng)用于甲殼素的提取，但其純度依舊有限，符合工業(yè)級(jí)要求的較少。微生物發(fā)酵法依舊存在產(chǎn)酸和蛋白酶不足的問(wèn)題，導(dǎo)致脫鹽和脫蛋白質(zhì)不夠充分，并且產(chǎn)酸的速度相對(duì)較慢，常導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中原料腐敗。因此，篩選高產(chǎn)酸、產(chǎn)酶菌株，通過(guò)基因工程改造菌株，提高酸和蛋白酶的產(chǎn)量和產(chǎn)率是微生物發(fā)酵提取甲殼素的重點(diǎn)研發(fā)方向。

3 殼聚糖制備

甲殼素溶解性能較差導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制，在脫乙酰作用下，當(dāng)乙酰化程度（摩爾分?jǐn)?shù)）低于50%時(shí)，即成為其最重要的脫乙酰衍生物殼聚糖，一般認(rèn)為是甲殼素不同程度脫乙酰后的一類(lèi)聚合物。與甲殼素相比，殼聚糖的溶解性能得到改善，分子間作用力相對(duì)較弱，糖基環(huán)中除含有活性羥基外，還存在游離氨基和羥基，化學(xué)修飾更加多樣化［11，45］。因此，殼聚糖的制備成為完善甲殼素衍生化學(xué)體系的重要前提?，F(xiàn)階段，甲殼素通過(guò)化學(xué)法或生物法均能夠制備殼聚糖，在工業(yè)上，由于化學(xué)法的低投入以及穩(wěn)定的規(guī)?；a(chǎn)而被廣泛采用。

從化學(xué)的角度看，酸或者堿都可以用于甲殼素的脫乙?；捎谔擒真I對(duì)酸較為敏感，在酸條件下易斷裂，通常脫乙?；趬A性條件下進(jìn)行。甲殼素在濃NaOH熱溶液處理幾個(gè)小時(shí)后，脫乙酰率在85%-99%之間［46］，但這會(huì)造成N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖不規(guī)則的分布于聚合物的主鏈中，導(dǎo)致殼聚糖在水溶液中更容易聚集而影響其溶解性，進(jìn)一步影響殼聚糖的物理化學(xué)性質(zhì)。例如，平均分子量、在水中的黏度等［47］，同時(shí)也存在能耗大、濃堿廢液和產(chǎn)物降解等一系列問(wèn)題。生物法因其溫和的作用條件，環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)而逐漸應(yīng)用于殼聚糖的制備生產(chǎn)中。

3.1 酶法脫乙酰

甲殼素脫乙酰酶（Chitin deacetylase，CDA，EC 3.5.1.41）能夠催化甲殼素中N-乙酰胺基水解生成殼聚糖，該活性酶存在于多種真菌及昆蟲(chóng)物種，其中研究較多的脫乙酰酶分別提取于Mucor circinelloides［48］、Aspergillus nidulans［49］及Colletotrichum lindemuthianum［50］。 上 述 CDA 通 常存在于胞質(zhì)區(qū)域或分泌于菌種培養(yǎng)基中，并且脫乙酰酶具有良好的熱穩(wěn)定性（最優(yōu)作用溫度為50-60℃），并且對(duì)β-（1，4）-N-乙酰-D-葡萄糖胺聚合物具有很強(qiáng)的專(zhuān)一性。

研究表明，CDA屬于糖脂酶家族4（Carbohydrate esterase family4，CE-4），其結(jié)構(gòu)特性有很多相似性，來(lái)源于Colletotrachum landemuthaanum的CDA是由一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的單核金屬酶。其酶水解的作用機(jī)理也與CE-4成員類(lèi)似，是一種多點(diǎn)進(jìn)攻模式，即可以同時(shí)脫去多個(gè)位點(diǎn)的乙?；?1］。另外，研究發(fā)現(xiàn)，相比較于晶態(tài)甲殼素，CDA更容易作用于無(wú)定型甲殼素，這是因?yàn)?，CDA是通過(guò)接近甲殼素分子進(jìn)而脫除乙酰基完成其作用的，當(dāng)甲殼素結(jié)晶成為纖維狀后，CDA便很難在進(jìn)入內(nèi)部，這就造成了乙酰基脫除的困難［52］。

甲殼素脫乙酰酶常被用于殼聚糖生產(chǎn)［53］，代替現(xiàn)有的濃堿熱解法以生產(chǎn)高品質(zhì)的殼聚糖，與化學(xué)過(guò)程相比，酶法脫乙酰過(guò)程更為可控，從而更好地生產(chǎn)新型、具有明確定義的殼聚糖產(chǎn)物，同時(shí)該方法也可專(zhuān)門(mén)用于殼聚糖低聚物的生產(chǎn)，這些都是化學(xué)法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。值得注意的是，與其他種類(lèi)酶的特性不同，由Colletotrichum lindemuthianum生產(chǎn)的甲殼素脫乙酰酶不存在產(chǎn)物（乙酸鹽）抑制作用，因此，更具有潛在的生物技術(shù)應(yīng)用前景［54-55］。

在殼聚糖制備過(guò)程中，無(wú)論是晶型的還是非晶型的甲殼素都很難溶解，非均相體系降低了脫乙酰酶和底物的可及性，從而導(dǎo)致脫乙酰酶作用效果較差，脫乙酰率較低（＜10%），這一點(diǎn)與纖維素的酶解類(lèi)似。因此，在添加脫乙酰酶前對(duì)底物預(yù)處理可以有效地增加脫乙酰酶對(duì)底物的可及性，從而提高脫乙酰的效率。有研究驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，竇勇等［56］以淡水小龍蝦殼為原料，經(jīng)EDTA法提取甲殼素，采用超聲輔助CDA酶法制備殼聚糖，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)超聲功率476 W，時(shí)間60 min的預(yù)處理后，同樣在酶添加量9.45%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間3.5 h條件下，殼聚糖脫乙酰度高達(dá)91.09%，相對(duì)得率81.87%。此外，離子液體的使用可以使脫乙酰作用在均相體系中完成，研究發(fā)現(xiàn)，［Amim］［Cl］可以使甲殼素脫乙酰環(huán)境趨于均相，與未添加離子液體的酶解體系相比較，脫乙酰酶的活性提高了39%［57］，為殼聚糖的制備提供了新的思路。

現(xiàn)階段，由于甲殼素脫乙酰酶的來(lái)源較窄，大部分來(lái)源于真菌，產(chǎn)酶菌株活力不高，分離提取不成熟，另外，酶解催化機(jī)理研究較少［58］，這些都制約了酶法脫乙酰的發(fā)展，使其局限于實(shí)驗(yàn)室研究。

3.2 微生物發(fā)酵制備殼聚糖

以上介紹的殼聚糖主要是從蝦蟹殼中提取，然而由于蝦蟹殼不易收集、且其質(zhì)量無(wú)法保證穩(wěn)定；蝦蟹殼不易儲(chǔ)備，時(shí)間長(zhǎng)了容易發(fā)生腐敗。近年來(lái)在發(fā)酵技術(shù)方面的研究進(jìn)展表明，這些問(wèn)題都可以通過(guò)培養(yǎng)生產(chǎn)殼聚糖的真菌來(lái)克服，尤其是接合真菌，這類(lèi)菌含有1%-10%細(xì)胞干重的殼聚糖。相比較從蝦、蟹殼中提取殼聚糖，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)殼聚糖有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）作為原料的真菌大部分可以大規(guī)模培養(yǎng)，并且不受地域和季節(jié)的限制；（2）可以通過(guò)控制培養(yǎng)時(shí)間從而獲得不同分子量的殼聚糖；（3）聚合度均勻，脫乙?；潭雀?；（4）工藝簡(jiǎn)單，能耗低并且環(huán)境友好；（5）利用工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的富含殼聚糖的廢棄菌絲發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖，變廢為寶的同時(shí)還可以較少環(huán)境污染。另外，由真菌發(fā)酵生產(chǎn)的殼聚糖具有較高的純度和品質(zhì)，適用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。

近些年來(lái)，利用菌種發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖的研究得到了越來(lái)越多的關(guān)注，如黑曲霉、酵母、甘格氏菌、毛霉菌和根霉菌等［59-60］。表1中匯總了常見(jiàn)的接合真菌生產(chǎn)殼聚糖的產(chǎn)量和脫乙?；潭?。研究人員對(duì)幾種不同真菌的生產(chǎn)潛力進(jìn)行了評(píng)估。Pochanavanich等［61］考 察 了 真 菌Aspergillus niger、Rhizopus oryzae、Lentinus edodes、Pleurotus sajocaju、Zygosaccharomyces rouxiiTISTR5058和Candida albicansTISTR5239在復(fù)合培養(yǎng)基中生產(chǎn)殼聚糖的能力。從上述菌株中分離出來(lái)的殼聚糖產(chǎn)量為10-140 mg/g細(xì)胞干重，脫乙酰度為84%-90%，分子量2.7×104-1.9×102kD，黏度是 3.1-6.2 cP。Rane等［62］研究了菌種Absidia. Coerulea、Absidia blakesleeana、G. butleri、Mucor rouxii和Phvcomyces blakesleeanus在簡(jiǎn)單的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基中殼聚糖的生產(chǎn)，結(jié)果表明Absidia. coerulea殼聚糖最大產(chǎn)量為510 mg/L（培養(yǎng)48 h），脫乙酰度為94%，當(dāng)介質(zhì)中添加鈷元素后，殼聚糖產(chǎn)率可增加20%。Muzzarelli等［63］進(jìn)一步優(yōu)化了培養(yǎng)條件，Absidia.coerulea培養(yǎng)72 h生物質(zhì)產(chǎn)量為6-7 g干重/L，其中殼聚糖約占30%即1.8 g/L，脫乙酰率為95%，平均分子量為500 kD。Kim等［64］進(jìn)一步報(bào)道Absidia.coerulea在pH 4.5，攪拌速度250 r/min和曝氣率2 vvm等優(yōu)化條件下可連續(xù)生產(chǎn)殼聚糖，產(chǎn)率可到52 mg/L/h。Tasara等［66］系統(tǒng)研究了采集于土耳其埃爾祖魯姆地區(qū)的菌種Rhizopus oryzaePAS 17（基因庫(kù)登錄號(hào)KU318422.1）在非無(wú)菌條件下發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖，利用其可以在較低溫度和pH條件下生長(zhǎng)的特性以抑制其他微生物的污染。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了對(duì)殼聚糖生產(chǎn)影響最明顯的五個(gè)因素，分別是碳源（糖蜜）、金屬離子（Mg2+）、接種量、轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時(shí)間，得到最優(yōu)的培養(yǎng)條件：糖蜜70 mL/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，接種量6.7×106孢子/瓶，攪拌速度150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間8 d。結(jié)果顯示，殼聚糖和生物量產(chǎn)量分別是未優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的14.45和8.58倍。

利用發(fā)酵法得到的環(huán)保型殼聚糖可以作為抗菌劑應(yīng)用于眾多領(lǐng)域。Gharieb等［72］研究了3種真菌（Cunninghamella elegansRCMB 012002，Mucor rouxiiRCMB 015002和Rhizopus.sp）生產(chǎn)的殼聚糖，以及殼聚糖對(duì)抗不同致病微生物的抗菌活性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Mucor rouxii，Rhizopussp和Cunninghamella elegans生產(chǎn)的殼聚糖其脫乙酰度分別為80.3%、81.5%和80.3%。為進(jìn)一步提高真菌的殼聚糖產(chǎn)量，優(yōu)化了培養(yǎng)基、碳源、氮源、pH值及溫度等培養(yǎng)條件，結(jié)果表明，以上3種真菌在YPG培養(yǎng)條件下殼聚糖產(chǎn)量分別提高到440、240和640 mg/L。通過(guò)對(duì)比表明以葡萄糖為碳源可以獲得較高的殼聚糖產(chǎn)率，最適發(fā)酵溫度為30℃，其中Mucor rouxii和Cunninghamella elegans最好的氮源為硝酸鈉，最適pH為5；Rhizopussp.最好的氮源為尿酸，最適pH為4.5。利用上述3種真菌生產(chǎn)的殼聚糖作為抗菌劑對(duì)抗致病微生物，如金黃色葡萄球菌（ATCC-47077）、大腸桿菌（ATCC-25922）、白色念球菌（ATCC-0231）和尖孢鐮刀菌，結(jié)果表明以上3種真菌都有不同的抗菌活性，計(jì)算得到的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）在100-1 500 ppm之間。

表1 常見(jiàn)殼聚糖生產(chǎn)的接合真菌

通過(guò)更換廉價(jià)的發(fā)酵碳源可以進(jìn)一步降低發(fā)酵成本，Yang等［73］利用稀酸蒸爆預(yù)處理后富含木糖的玉米秸稈為碳源，研究了Rhizopus oryzaeAS 3.819發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖的情況，玉米秸稈預(yù)處理料中含30 g/L木糖和10 g/L葡萄糖，發(fā)酵72 h后，殼聚糖產(chǎn)量為90 g/kg，殼聚糖的脫乙酰度（91.27%）高于利用天然貝類(lèi)生產(chǎn)的商業(yè)化殼聚糖（87.25%），殼聚糖黏度（2.67 mPa·s）比商業(yè)化的殼聚糖黏度（22.25 mPa·s）有了較大程度的降低。

目前殼聚糖主要還是以蝦蟹殼為原料生產(chǎn)，由于其生產(chǎn)成本高、聚合度不均勻、質(zhì)量不穩(wěn)定以及環(huán)境不友好等原因，導(dǎo)致其產(chǎn)品品質(zhì)不高。微生物發(fā)酵法雖然也存在成本問(wèn)題，但在一定程度上解決環(huán)境污染問(wèn)題，若利用廢棄菌絲變廢為寶的同時(shí)還可以制得高品質(zhì)的殼聚糖，從而滿足在食品、醫(yī)藥及化妝等領(lǐng)域中的應(yīng)用。

4 結(jié)語(yǔ)

甲殼素/殼聚糖作為一種“動(dòng)物性”纖維素，在紡織印染、造紙、農(nóng)業(yè)、食品、化妝品及醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域有著越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，逐漸成為了繼木質(zhì)纖維素后另一種可再生資源新體系。甲殼素/殼聚糖的提取制備工藝很多，酸堿法為現(xiàn)行的工業(yè)化甲殼素提取工藝，但是提取工程中使用大量的酸堿，消耗能源的同時(shí)還會(huì)造成環(huán)境污染，后續(xù)污染物處理耗費(fèi)高，已經(jīng)成為甲殼素衍生化學(xué)未來(lái)發(fā)展的瓶頸。酶法及微生物發(fā)酵法是節(jié)能、環(huán)境友好型的生產(chǎn)技術(shù)，可以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的甲殼素和殼聚糖，但如何解決成本高且提取效率低的問(wèn)題也成為了制約生物法工業(yè)化的關(guān)鍵所在，如酶催化發(fā)制備甲殼素存在蛋白殘留率高，微生物發(fā)酵法制備甲殼素存在微生物產(chǎn)酸產(chǎn)酶速度慢，脫鹽脫蛋白不夠充分，酶法制備殼聚糖過(guò)程中產(chǎn)CDA菌株活力不高，提取技術(shù)不成熟等問(wèn)題，這些都限制了生物法工業(yè)化的進(jìn)程。鑒于目前存在的諸多問(wèn)題，可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行改善：其一，通過(guò)誘變篩選產(chǎn)酶、產(chǎn)酸多的優(yōu)勢(shì)菌種，優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵參數(shù)，提高發(fā)酵效率；其二，開(kāi)發(fā)新的提取工藝，如生物/化學(xué)法有機(jī)結(jié)合，提高產(chǎn)品純度，擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，以達(dá)到工業(yè)化的要求；其三，可以利用廢棄的菌絲如青霉素、檸檬酸發(fā)酵的廢菌絲體等，解決環(huán)境問(wèn)題的同時(shí)獲得高附加值的殼聚糖。另外，我國(guó)甲殼素/殼聚糖生產(chǎn)處于整個(gè)生產(chǎn)鏈的前端，存在產(chǎn)品種類(lèi)相對(duì)單一，技術(shù)含量低，甲殼素/殼聚糖深加工及應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足等問(wèn)題，因此，今后應(yīng)該在保證綠色環(huán)保生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的同時(shí)，進(jìn)一步加大對(duì)甲殼素衍生物的研發(fā)力度，增加高附加值產(chǎn)品的產(chǎn)出，實(shí)現(xiàn)其在更多領(lǐng)域的應(yīng)用。