(皖南醫(yī)學院寄生蟲教研室，安徽 蕪湖 241002)

毛蚶(Scapharca subcrenata)屬于軟體動物門雙殼綱(Bivalvia)、魁蛤目、魁蛤科、毛蚶屬，肉質(zhì)豐富，含有豐富的天然活性成分，具有很大的食用藥用價值，是重要的海洋資源，多糖就是天然活性成分之一。天然多糖是天然產(chǎn)物中的一大類，又稱多聚糖，是生物體重要組成部分，重要的天然產(chǎn)物資源之一[1]。天然多糖有抗氧化[2-3]、抗炎[4]、抗腫瘤[5-6]、抗輻射[7]、提高免疫力[8]等生物學功能，對治療和預防多種疾病具有巨大潛力。

天然多糖最常用的提取方法主要有水浸提法、酸堿提法、超聲波輔助提取法、復合酶提取法等，不同方法各有各的優(yōu)缺點[9-10]。貝類屬于動物，含有大量蛋白質(zhì)，所以貝類多糖提取與純化比植物多糖困難。為了防止多糖的結(jié)構(gòu)在反復提取與純化過程中被破壞，本研究采用簡單、經(jīng)濟且不破壞多糖結(jié)構(gòu)的熱水浸提法提取毛蚶多糖[11]。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 毛蚶(產(chǎn)地中國揚州)，丙酮、無水乙醇、 蒽酮、濃硫酸、雙蒸水、 三氯甲烷、 正三醇、 H2O2(試劑均為分析純)；D105大孔樹脂 ，10—20目活性炭(合肥睿捷生物有限公司)，考馬斯亮藍試劑盒(合肥睿捷生物有限公司)。

1.2儀器 SHKE6000-8CE震蕩儀(美國賽默飛世爾公司)、TP-8XL真空冷凍干燥機(美國SP Scientific公司)、Infinite 200PRO多功能酶標儀、 Hei-VAP HL Adv真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國德祥科技有限公司)、J-26XP離心機(美國Beckman Coulter)。

1.3提取工藝

1.3.1毛蚶多糖提取 取新鮮活毛蚶2000 g去殼，取肉反復清洗，勻漿，勻漿液加等倍體積丙酮浸泡24 h脫脂，倒去丙酮冷凍真空干燥得脫脂毛蚶干粉，準確稱取脫脂后的毛蚶干粉2 g，以提取溫度、浸提時間、料液比為可變因素水浴攪拌提取。將提取液以6000 r/min上離心機，離心20 min，取上清液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/3，加4倍體積無水乙醇4℃過夜，倒去乙醇收集沉淀，沉淀分別用丙酮和無水乙醇反復清洗3次，雙蒸水復溶即得毛蚶粗多糖溶液。

1.3.2脫蛋白 采用較溫和的sevage(三氯甲烷與正三醇4∶1)法[12]脫蛋白， sevage試劑與多糖溶液3∶1(V/V)置于搖床劇烈搖動2 h后5000 r/min離心20 min，溶液分三層，用吸管將上層多糖溶液吸出，重復此步驟直至無中間蛋白層析出。

1.3.3脫色

1.3.3.1脫色率測定 用全自動酶標儀在420 nm波長下檢測毛蚶多糖脫色前后吸光值(OD)，根據(jù)公式脫色率(%)=(A1-A2)/A1×100%，A1是脫色前的多糖溶液的OD值，A2是脫色后的OD值。

1.3.3.2活性炭脫色 準確稱量0.05 g、0.10 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g、0.30 g、0.35 g、0.40 g活性炭，然后分別置于8支試管中，向各試管加入已脫蛋白的多糖溶液3 ml， 60℃水浴60 min， 10 000 r/min離心20 min,分別吸取各管上清液測量各試管中多糖脫色率及多糖損失率。

1.3.3.3過氧化氫(H2O2)脫色 向5 ml多糖溶液中加入不同濃度的雙氧水(H2O2)溶液(4%、8%、12%、16%、20%、24%、28%)，于60℃水浴60 min，分別測量各管多糖脫色率及損失率。

1.3.3.4大孔樹脂脫色 分別以濃度為0.02 g/ml、0.04 g/ml、0.06 g/ml、0.08 g/ml、0.10 g/ml、0.12 g/ml、0.14 g/ml大孔樹脂脫色，分別檢測各管多糖脫色率及損失率。

1.3.4毛蚶多糖正交試驗設計 見表1。

表1 毛蚶多糖正交試驗因素水平

1.3.5多糖的測定 通過硫酸-蒽酮法測多糖含量。 硫酸蒽酮溶液配制：稱取0.1 g蒽酮置于50 ml容量瓶中用濃硫酸定容至刻度線，并用超聲波混勻，得0.02 g/ml硫酸蒽酮溶液置于棕色玻璃瓶中備用。標準葡萄糖溶液配制：將無水葡萄糖在105℃下干燥至恒重，準確稱取200.00 mg置于1 L容量瓶中，雙蒸水定容至刻度線，得0.20 mg/ ml標準葡萄糖溶液。標準曲線繪制 ：取5支10 ml潔凈試管分別加入0.10 ml、0.20 ml、0.30 ml、0.40 ml、0.50 ml標準葡萄糖溶液，用雙蒸水將體積不足0.50 ml的試管補至0.50 ml，向各試管中加硫酸蒽酮溶液2.00 ml并用橡皮塞塞緊試管口，小心充分搖勻后置于100℃沸水中水浴10 min，取出試管冰浴10 min。全自動酶標儀在625 nm波長測OD值，并根據(jù)OD值繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線得回歸方程為：y=3.5957x-0.0059，相關(guān)系數(shù)r2=0.9947。多糖含量可根據(jù)回歸方程計算，多糖提取率(%)=每份樣品所含多糖質(zhì)量/每份原料的質(zhì)量×100%。多糖損失率(%)=(脫色前的多糖量-脫色后的多糖量)/脫色前的多糖量×100%。

2 結(jié)果

2.1毛蚶多糖的提取 毛蚶多糖提取工藝優(yōu)化，以液固比、提取的溫度、提取的時間3個因素做正交試驗，見表1、表2。由表3可知液固比對毛蚶多糖的提取率影響最大，提取的時間對毛蚶多糖提取率影響最小，影響因素大小依次為固液比>提取溫度>提取時間，從表2可知毛蚶多糖提取最優(yōu)工藝是A2B3C1，液固比為35∶1(ml/g)、溫度為80℃、時間為2 h時提取率最高，為9.20%。

表2 毛蚶多糖提取正交試驗結(jié)果

表3 毛蚶多糖正交實驗結(jié)果方差分析

2.2H2O2脫色 加入H2O2濃度為12%時脫色效果最好，脫色率為58.90%，多糖損失率為28.90%。見圖1。

圖1 H2O2濃度對多糖脫色率及損失率的影響

2.3活性炭脫色 活性炭添加量為0.08 g/ml時脫色效果最佳，脫色率為61.90%，多糖損失率為32.70%。見圖2。

圖2 活性炭對多糖脫色率及損失率的影響

2.4大孔樹脂脫色 添加大孔樹脂含量為0.1 g/ml時，脫色率為66.60%，多糖損失率為27.50%。見圖3。

圖3 大孔樹脂對多糖脫色率及損失率的影響

3 討論

貝類多糖提取有熱水浸提法、復合酶提法、酸堿提取法、超聲波輔助提取法等，酸堿提取法需嚴格控制pH值且可能破壞多糖結(jié)構(gòu)，復合酶提取法提取效率高但可能會引入新的蛋白質(zhì)，且對提取溫度及pH值要求嚴格，熱水浸提法雖然提取率相對低，但具有操作簡單且不破壞多糖結(jié)構(gòu)等優(yōu)點，為最常用的多糖提取方法。本研究通過熱水浸提法對毛蚶多糖在不同液固比、提取溫度、提取時間進行正交試驗探討毛蚶多糖最佳提取條件。

多糖脫色方法主要有H2O2[13]、活性炭[14]、大孔樹脂[15]3種工藝，3種脫色工藝對毛蚶多糖脫色率及多糖損失率分別為：H2O2脫色率為58.90%，多糖損失率為28.90%；活性炭脫色率為61.90%，損失率為32.70%；大孔樹脂脫色率為66.60%，多糖損失率27.50%，其明顯優(yōu)于活性炭及H2O2脫色工藝。 H2O2脫色是利用氧化反應使有色物質(zhì)失去顏色，脫色效果明顯，但有色物質(zhì)仍然存在于多糖溶液中且H2O2影響硫酸蒽酮法測多糖，需要加熱去除后方能用硫酸蒽酮法測多糖含量；活性炭脫色操作方便，快捷，價格低廉，脫色效果明顯，應用最廣泛，活性炭粉末混入溶液中需高速離心后去除；大孔樹脂脫色效果最好且多糖損失率低，但價格較活性炭和H2O2昂貴且脫色時間長，操作復雜。

綜上所述毛蚶多糖熱水浸提法最佳提取工藝為液固比35∶1(ml/g)、溫度為80℃、提取時間為2 h時，提取率最高為9.20%。大孔樹脂脫色的脫色率為66.60%，明顯優(yōu)于H2O2法(58.90%)和活性炭(61.90%)，大孔樹脂脫色多糖損失率(27.50%)較H2O2法(28.90%)和活性炭法(32.70%)低。毛蚶多糖提取工藝的研究為毛蚶多糖的組分、分子量、分子結(jié)構(gòu)及生物活性研究提供基礎。