余振興，鄧 磊，張先斌， 胡祖力，祝新根， 吳淼經(jīng)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤亦被稱為膠質(zhì)細胞瘤，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，約占顱腦腫瘤的50%。按照腫瘤的起源可分為：星形細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤及少突膠質(zhì)細胞瘤[1]。由于膠質(zhì)瘤細胞所處特殊位置，藥物治療療效差、手術(shù)難度大、易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)[2]。小分子RNA-182(microRNA，miR-182)為編碼區(qū)序列，通過調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄而影響相關(guān)蛋白的表達，影響細胞的增殖、凋亡和分化[3]。研究[4]顯示，miR-182在癌細胞組織中高表達?！安骖^蛋白”的O亞家族(forkhead, FOXO3a)是由FOXO3基因編碼的一類蛋白質(zhì)，F(xiàn)OXO3a蛋白在肝癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、淋巴瘤、白血病等多種惡性腫瘤細胞中均有表達[5]。該研究通過對膠質(zhì)瘤U251細胞系中miR-182與FOXO3a的相互作用關(guān)系，探討miR-182通過對FOXO3a蛋白的調(diào)控對膠質(zhì)瘤細胞的增殖與侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器膠質(zhì)瘤細胞U251購自上海中科院細胞所；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶及脂質(zhì)體Lipofectamine2000均購自美國Invitrogen公司；胎牛血清及雙抗(100 U/ml青霉素與100 g/L鏈霉素組成)購自美國Gibco公司；FOXO3a一抗(兔抗)購自美國Cell Signaling公司；FOXO3a二抗(羊抗兔)購自北京康為世紀公司；β-action內(nèi)參購自德國Tiangen公司；BCA蛋白濃度試劑盒、PCR擴增儀購自購自美國Thermo公司；miR-182與抑制劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABI公司；熒光素酶基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；低溫離心機購自德國Eppendoff公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染向U251細胞與正常人星型細胞分別加入含10%胎牛血清與1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基溶液，制成懸液，放入培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期，加入胰酶進行消化，獲得U251細胞懸液，按照分組分別加入對照組、無義序列miR-182、miR-182 micmics已整合成功的脂質(zhì)體，完成細胞轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)約48 h直至轉(zhuǎn)染成功后的細胞進入對數(shù)期。

1.3 構(gòu)建FOXO3a質(zhì)粒使用pc DNA3作為空載體質(zhì)粒，報告強化綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)質(zhì)粒載體，分別將野生型(亦稱無干擾型)FOXO3a 3′-非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)與突變型(亦稱過表達型)FOXO3a 3′-UTR序列復(fù)制后導(dǎo)入pc DNA3載體，得到無干擾型與過表達型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒。

1.4 進行熒光素酶報告實驗將長滿瓶底約80%的U251細胞消化后接種于96孔板，正常培養(yǎng)過夜，顯微鏡下觀察，細胞密度超過75%時分別加入：A組突變型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒；B組共轉(zhuǎn)染突變型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒和無義序列；C組共轉(zhuǎn)染突變型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒和miR-182 mimics；D組野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒；E組共轉(zhuǎn)染野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒和無義序列；F組共轉(zhuǎn)染野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒和miR-182 mimics。待質(zhì)粒與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染成功后，按照熒光素酶試劑盒操作，測定對應(yīng)熒光素酶活性。

1.5 Western blot檢測FOXO3a蛋白表達收集轉(zhuǎn)染成功后不同處理的U251細胞，得細胞懸液，PBS清洗3次，取下層細胞，加入蛋白裂解液(PMSF與 RIPA按照1 ∶100)提取蛋白；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集蛋白沉淀；BCA試劑盒測定標準蛋白曲線；按照實驗流程配制好分離膠與濃縮膠，依次加入樣品，設(shè)定電壓80 V/120 V；待溴酚藍出現(xiàn)在膠底附近時，電泳結(jié)束；按照膠塊、PVDF膜處于正中間，兩邊依次為三層濾紙、海綿的順序放置好，進行轉(zhuǎn)膜，持續(xù)時間為90 min；使用TBST溶液洗脫3次，邊洗邊振搖，每次10 min；5%脫脂牛奶封閉結(jié)束后，孵育對應(yīng)1抗過夜，繼續(xù)TBST洗膜3次，每次10 min，加入對應(yīng)辣根過氧化物標記的二抗，孵育1 h；選用ECL顯影液顯影結(jié)束后，應(yīng)用Image J軟件進行灰度分析。

1.6 qRT-PCR測定FOXO3a mRNA表達采用TRIzol裂解液快速提取不同處理細胞中mRNA，加入TRIzol溶液與氯仿(5 ∶1)混合液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，得到3個相層；輕輕吸取上層無色含RNA水層，加入等體積異丙醇混勻，離心，保留下層沉淀；加入TRIzol溶液與75%乙醇混合液(1 ∶1)，對RNA繼續(xù)清洗以去除雜質(zhì)，離心，得到純度更高的RNA提取物；將EP管倒扣于吸水紙上進行干燥，加入無RNase的水，混合均勻后備用。依次加入2 μl 10×RT工作液、4 μl 25 mmol/L MgCl2、2 μl 0.1 mol/L DTT、1 μl RNaseOUT(40 U/μl)、1 μl SuperScript RT(200 U/μl)合成引物序列，按照預(yù)變性95 ℃、10 min；變性95 ℃、15 s；退火56 ℃、60 s；延伸72 ℃、32 s程序設(shè)置PCR擴增。選用GAPDH作為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 基因GADPH、FOXO3a引物序列

1.7 MTT法測定細胞增殖將正常U251細胞與轉(zhuǎn)染siRNA-miR-182、miR-182 mimics及過表達FOXO3a成功的細胞進行培養(yǎng)，48 h后收集細胞，制備細胞懸液，按照3 000～8 000個/孔進行96孔板點板，每種設(shè)6個復(fù)孔；培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1～5 d后，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入100 ml DMSO，搖床低速振蕩10 min，酶標儀490 nm處測定吸光度值。

1.8 Transwell法測定細胞侵襲能力將轉(zhuǎn)染不同處理的細胞分別接種于Transwell上室(有/無Metrigel膠)，下室為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)36 h后，蘇木精染色封片，測定穿過孔的細胞數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測定轉(zhuǎn)染miR-182對U251增殖能力的影響培養(yǎng)第1天，各組轉(zhuǎn)染后的U251細胞增殖數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)第2～3天，與對照組及無義序列組比較，轉(zhuǎn)染miR-182 mimics組細胞數(shù)顯著增加(P<0.01)；第3～5天，miR-182 mimics組細胞數(shù)雖有減小，但與對照組及無義序列組比較，其細胞數(shù)量仍呈顯著性增加(P<0.05)。第1～5天，無義序列組U251細胞，細胞數(shù)量開始呈增加趨勢后逐漸減少；與對照組細胞數(shù)比較，無義序列組細胞數(shù)無顯著變化(P>0.05)。見圖1。

2.2 Transwell法測定轉(zhuǎn)染miR-182對U251侵襲能力的影響3組間穿過小室的細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，miR-182 mimics組穿過小室細胞數(shù)顯著增多(t=5.577,P=0.005)。見表2、圖2。

圖1 MTT法測定轉(zhuǎn)染miR-182 U251細胞的增殖能力

組別細胞數(shù)對照36.9±3.4無義序列34.6±2.7miR-182 mimics54.3±4.2F值6.551P值<0.05

圖2 Transwell法測定轉(zhuǎn)染miR-182對U251侵襲能力的影響×100

2.3 熒光素酶活性驗證結(jié)果經(jīng)Microma/miRBase/TargetScan靶基因數(shù)據(jù)庫篩選，將FOXO3a暫定為miR-182調(diào)控的下游靶基因。經(jīng)熒光素酶報告實驗驗證，A ～E組熒光素酶對應(yīng)活性，見圖3；兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，miR-182 mimics與pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR共轉(zhuǎn)染組(C組)熒光素酶活性明顯較其他組低(P<0.01)，證實miR-182可抑制突變型質(zhì)粒的熒光素酶活性，F(xiàn)OXO3a是miR-182調(diào)控的直接作用靶點。

圖3 熒光素酶活性驗證結(jié)果

A組：突變型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒； B組：共轉(zhuǎn)染突變型pc DNA3/ EGFP -FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒和無義序列； C組：共轉(zhuǎn)染突變型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒和miR-182 mimics； D組：野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒； E組：共轉(zhuǎn)染野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒和無義序列； F組：共轉(zhuǎn)染野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR質(zhì)粒和miR-182 mimics；與A組比較：**P<0.01

2.4 轉(zhuǎn)染miR-182后U251細胞內(nèi)FOXO3a的蛋白表達情況Western blot 檢測FOXO3a蛋白的表達，3組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.128，P<0.05)；與對照組比較，miR-182 mimics組FOXO3a蛋白含量顯著降低(P<0.05)。在qRT-PCR實驗中，3組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.227，P<0.05)；與對照組比較，miR-182 mimics組FOXO3a mRNA含量顯著降低(P<0.05)。見圖4。

2.5 突變型FOXO3a干擾U251細胞增殖與遷移變化與野生型FOXO3a干擾U251細胞組比較，MTT實驗測定第1～3天，突變型組細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)；第4～5天，突變型組細胞數(shù)有減小趨勢，與野生型組比較，其細胞數(shù)仍顯著偏多(P<0.05)。在Transwell小室實驗中，培養(yǎng)36 h后，與野生型組穿過細胞數(shù)(37.8±2.8個)比較，突變型組穿過小室的細胞數(shù)(25.2±2.64個)顯著減少(P<0.05)。見圖5。

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞異常增殖與轉(zhuǎn)移引起的惡性腫瘤之一，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的3/5[6]。膠質(zhì)瘤細胞極易向周圍浸潤，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤手術(shù)切除難度大，術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)；盡管隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進步，膠質(zhì)瘤患者的5年生存率仍然低至5%[7]。生命體的正常生長發(fā)育得益于基因精準的、多方位的整體調(diào)控。無論是基因本身的堿基序列發(fā)生微小改變，還是非編碼區(qū)的調(diào)控序列發(fā)生異常，都會使機體的生理活動發(fā)生異常，這種異常超出機體的自我調(diào)節(jié)承受范圍，即出現(xiàn)病理狀態(tài)。miRNAs是一類自身無法直接表達蛋白質(zhì)、可對下游基因蛋白質(zhì)表達進行調(diào)控的小分子密碼子[8]。有研究[9]者提出，下游靶mRNA的3′UTR為調(diào)控miRNA的主要結(jié)合位點。如miRNA-663可通過調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)移生長因子-β抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲；miRNA-506可調(diào)控下游靶基因胰島素樣生長因子2 mRNA的結(jié)合蛋白1抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖[10-11]。miR-182為miR-183-96-182家族一員，位于人類第7號染色體，被證實為具有癌基因功能。在多種膠質(zhì)瘤細胞信號通路中均顯示miR-182扮演著重要角色，F(xiàn)eng et al[12]證實miR-182過表達可調(diào)控神經(jīng)突起生長素(neuritin，NRN1)基因與NRN1蛋白表達從而控制膠質(zhì)瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移；Xue et al[13]等證實miR-182-5p的促進與抑制均可激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路，從而調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤的增殖與遷移。本研究中，對對照組、無義序列組、miR-182 mimics組的U251細胞進行培養(yǎng)后顯示，與其他兩組比較，轉(zhuǎn)染miR-182 mimics組的U251細胞增殖速度明顯加快，提示miR-182可促進膠質(zhì)瘤U251細胞的生長；在進行Transwell小室實驗顯示，轉(zhuǎn)染miR-182 mimics組的U251細胞穿過小室的細胞數(shù)明顯較其他兩組多，提示miR-182可促進膠質(zhì)瘤U251細胞的轉(zhuǎn)移；經(jīng)熒光素酶活性實驗驗證，miR-182 mimics與pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR共轉(zhuǎn)染組(C組)熒光素酶活性明顯較其他組低，證實FOXO3a是miR-182調(diào)控的直接作用靶點。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-182后U251細胞內(nèi)FOXO3a的

圖5 突變型FOXO3a干擾U251細胞增殖與遷移變化與野生型組比較：*P<0.05

FOXO3a是分子量為75 ku的蛋白質(zhì)，含有高度保守的翼螺旋結(jié)構(gòu)域，可被磷酸化或乙?；せ?。FOXO3a蛋白已被證實在受到蛋白激酶B與核因子κB激酶β的抑制劑等修飾激活后，其活性發(fā)生改變，可參與腫瘤細胞的生長與增殖。p53是一種重要的抑癌基因，當受到外界刺激時，F(xiàn)OXO3a與p53可相互促進以抑制腫瘤細胞的生長，且被證實二者為協(xié)同作用[14]。為近一步探討miR-182對FOXO3a調(diào)控趨勢，本研究選用脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染，使FOXO3a進入突變狀態(tài)，在體內(nèi)過表達，結(jié)果顯示：與對照組比較，進入FOXO3a蛋白突變狀態(tài)的U251細胞增殖速度與侵襲速度均顯著減小，突變狀態(tài)U251細胞中miR-182的mRNA含量顯著減小。