綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白的表達純化與鑒定

胡業(yè)輝，李益鵬，王紫英，陳 勖，任 真，丁 澦

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生理學(xué)與生物物理學(xué)系，上海 200438)

綠色熒光蛋白(GFP)作為一種標記分子，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因表達的檢測、靶蛋白在細胞或生物體內(nèi)的定位等研究[1-6].理論上通過GFP抗體可針對融合GFP的蛋白質(zhì)復(fù)合物進行操縱[7-8]，但由于GFP抗體分子較大，很難穿透細胞膜或克隆后進行傳代表達，且其與GFP結(jié)合位點多樣，限制了這一技術(shù)的應(yīng)用.1999年，Reiter等構(gòu)建了一組具有高度特異性和生物活性的重鏈可變區(qū)蛋白[9]，與傳統(tǒng)抗體不同的是，這種抗體由駱駝VHH鏈的單鏈抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域開發(fā)，僅由兩條重鏈組成，通常直徑為2.5nm、高度約4nm、分子量在12～15kDa，因此也被稱為納米抗體[10-11].納米抗體自身性質(zhì)穩(wěn)定，易于在各種表達系統(tǒng)中表達，在各種細胞中都能很好地折疊[12-14]，并且由于其體積較小，與抗原結(jié)合后空間位阻較小[15-16].2010年，Leonhardt等通過噬菌體庫篩選構(gòu)建出了針對GFP的納米抗體文庫GBP系列(GFP binding protein)[17]，但這些GBP與GFP及其衍生熒光蛋白的親和力等性質(zhì)有待進一步揭示.

我們首先大量表達、純化出重組GBP1蛋白，每升菌液可得到43mg純度超過95%的重組GBP1蛋白.通過分子篩層析、MST[18]和BS3交聯(lián)實驗，檢測了GBP1與sfGFP(綠色)，EGFP(綠色)，T-Sapphire(綠色，紫外激發(fā))，CyPet(青色)，YPet(黃色)，ZsGreen(綠色，來源于Zoanthus)和mDsRed(紅色)等7種熒光蛋白的結(jié)合能力.研究結(jié)果表明，GBP1僅能特異性地結(jié)合源自Aequoreavictoria的熒光蛋白及其衍生熒光蛋白，其中GBP1與EGFP(Kd=0.85nmol/L)的親和力最強.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌菌株E.coliDH5a、BL21(DE3)購自Novagen公司；KOD Plus聚合酶和DNA連接試劑盒購自Toyobo公司；核苷酸、瓊脂糖凝膠、DNA提取試劑盒和PCR純化試劑盒購自Roche Diagnostics公司；引物合成和DNA序列分析由Invitrogen公司完成；限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；Ni-NTA介質(zhì)購自Qiagen公司；Mono Q陰離子交換層析柱和分子篩層析柱Superdex75 Increase購自GE公司；BS3交聯(lián)試劑和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce公司；MST試劑均購自Nano Temper公司；所有其他藥物都為分析純試劑.

1.2 構(gòu)建原核表達載體

由PDB ID： 3K1K獲得GBP1的編碼序列[17]，對其進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列由Genewiz公司合成.將GBP1基因插入到pT7N10C6載體中，其N端帶有His-tag10標簽，交由測序公司對質(zhì)粒進行檢測.

1.3 GBP1蛋白與熒光蛋白的表達與純化

構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)菌株，挑取單克隆菌落，接種到含有100μg/mL氨芐青霉素的5mL LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜.按照Studier的方法制備自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基[19]，將0.5mL細菌懸浮液轉(zhuǎn)移至500mL含有同樣濃度氨芐青霉素的自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6后，將菌液轉(zhuǎn)移至20℃，繼續(xù)培養(yǎng)20h.最后，6000×g、20min離心收集菌體，-80℃保存.

首先通過Ni-NTA親和層析對GBP1蛋白進行純化.將凍存菌液充分重懸于A-Buffer(50mmol/L Tris-HCl[pH 8.0]，150mmol/L NaCl，10%(體積比)甘油，20mmol/L咪唑)中，冰上超聲裂解細菌，裂解液于4℃、20000×g、20min離心兩次，取上清.上清液低速流過A-Buffer預(yù)平衡的Ni-NTA層析柱，B-Buffer(50mmol/L Tris-HCl[pH8.0]，150mmol/L NaCl，10%(體積比)甘油，500mmol/L咪唑)將GBP1蛋白洗脫.

5倍體積的QA-Buffer(50mmol/L Tris-HCl[pH8.0]，10%(體積比)甘油)稀釋Ni-NTA洗脫液，稀釋液流過QA-Buffer預(yù)平衡的陰離子交換層析柱，QA-Buffer再次平衡后，0～0.9mol/L NaCl高鹽緩沖液線性梯度洗脫GBP1蛋白.4℃透析除去洗脫液中過多的鹽，透析緩沖液為： 50mmol/L Tris-HCl[pH8.0]，150mmol/L NaCl，0.5mmol/L EDTA，10%(體積比)甘油.通過SDS-PAGE和BandScan 4.30(Glyko)對純化后蛋白的純度和濃度進行分析.最后用儲存緩沖液(50mmol/L Tris-HCl[pH8.0]，150mmol/L NaCl，0.5mmol/L DTA，80%(體積比)甘油)將GBP1蛋白更換至含有40%甘油的緩沖液中，終濃度約2mg/mL，并儲存在-80℃.

熒光蛋白的克隆、表達和純化與GBP1蛋白類似，我們共表達純化了EGFP，sfGFP，CyPet，T-Sapphire，YPet，ZsGreen和mDsRed等7種熒光蛋白，且重組熒光蛋白純度均大于95%.

1.4 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜檢測

分子篩層析將純化后的GBP1蛋白換液至5mmol/L NH4Ac緩沖液中，取一管洗脫液用于Bruker FLEX MALDI-TOF儀器的線性模式MALDI-TOF檢測.相關(guān)參數(shù)： 加速電壓為27kV，平均進行100～150次掃描，分子量參照標準品為BSA蛋白(M+66431)(Sigma，St.Louis，MO，USA).

1.5 分子篩層析

分子篩層析緩沖液(GF-Buffer)為： 50mmol/L HEPES[pH7.4]、150mmol/L NaCl，GBP1與各熒光蛋白分別按照1∶1、1∶2和2∶1的摩爾比例混合后上樣，上樣量0.5mL，流速0.5mL/min.UV 280監(jiān)測蛋白總吸收峰，特定激發(fā)波長監(jiān)測熒光蛋白的特征吸收，根據(jù)洗脫峰的遷移判斷GBP1蛋白與熒光蛋白的結(jié)合.

1.6 微量熱泳動

將GBP1蛋白用MST-Buffer(含有0.1% Tween-80的GF-Buffer，以降低蛋白樣品的吸附)稀釋至7000nmol/L 或1400nmol/L.GBP1與CyPet，T-Sapphire，ZsGreen和mDsRed的結(jié)合能力較弱或不結(jié)合，因此在這些測試中GBP1的濃度為7000nmol/L，其他測試中GBP1的濃度為1400nmol/L.將熒光蛋白用GF-Buffer稀釋至10～500nmol/L.MST緩沖液將GBP1蛋白連續(xù)稀釋12～14個梯度，每個梯度10μL；加入等體積的熒光蛋白稀釋液，吹打混勻；室溫孵育5～10min后，將各梯度樣品轉(zhuǎn)移至Monolith NTTM毛細管中，Monolith NT.115儀器進行檢測.檢測數(shù)據(jù)通過Nanotemper分析軟件(1.5.41)進行分析，利用Thermoporesis+T Jump數(shù)據(jù)擬合結(jié)合曲線.

1.7 BS3交聯(lián)實驗

將GBP1蛋白和熒光蛋白更換到交聯(lián)緩沖液(20mmol/L PBS[pH7.5]，150mmol/L NaCl)中.分3組將GBP1蛋白和熒光蛋白預(yù)混： 第1組GBP1和熒光蛋白濃度均為0.02mmol/L；在第2組中，GBP1的濃度是0.04mmol/L，熒光蛋白是0.02mmol/L；在第3組中GBP1的濃度是0.02mmol/L，熒光蛋白是0.04mmol/L.BS3交聯(lián)劑溶于100% DMSO后加入到混合的蛋白樣品中，終濃度為3mmol/L，室溫孵育30min；加入終止緩沖液(1mol/L Tris-HCl[pH7.5])，孵育15min；樣品95℃煮沸，3min，12% SDS-PAGE鑒定.

1.8 等溫滴定量熱

將待測蛋白用GF-Buffer透析平衡過夜至緩沖液一致.將GBP1蛋白稀釋至125μmol/L，將熒光蛋白稀釋至12.5μmol/L，在MicroCal iTC200等溫滴定量熱儀用GBP1蛋白滴定熒光蛋白.兩次滴定的間隔時間為150s，共滴定19次，首次滴定體積為0.4μL，2～19次滴定體積為2.0μL，反應(yīng)溫度為25℃，樣品池反應(yīng)體積為0.204mL.等溫滴定量熱(ITC)實驗的結(jié)果由ITC Analyse軟件分析處理.

2 結(jié)果

2.1 GBP1蛋白的表達、純化及鑒定

為了提高GBP1蛋白的表達量，我們首先根據(jù)對密碼子進行優(yōu)化，然后選擇含有T7啟動子的pET衍生載體pT7His作為其表達載體.通過自動誘導(dǎo)系統(tǒng)大量表達GBP1蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析和Mono Q陰離子交換層析兩步純化，每升大腸桿菌培養(yǎng)液可得到43mg純度大于95%的重組GBP1蛋白(表1).如圖1(a)所示，純化后的GBP1蛋白主帶在15.5kD附近，大于理論分子量13.9kD，為此我們通過MALDI-TOF線性模式質(zhì)譜測定了樣品分子量，分析結(jié)果顯示(圖1(b))，GBP1蛋白的分子量為13.9kD，與理論計算分子量一致，SDS-PAGE遷移偏慢是由于GBP1蛋白自身遷移速度較慢所導(dǎo)致.分子篩層析檢測結(jié)果表明(圖1(c))GBP1蛋白的洗脫位置在13.45mL處，生理狀態(tài)下為單體.

表1 1L大腸桿菌培養(yǎng)液中GBP1蛋白的產(chǎn)量產(chǎn)率分析

圖1 GBP1蛋白的表達與純化Fig.1 Analysis of the expression and purification of GBP1(a) SDS-PAGE檢驗GBP1蛋白的表達與純化： 1. 自動誘導(dǎo)后全菌裂解液，2. 離心后全菌上清液，3. Ni-NTA流出液，4. Ni-NTA高鹽清洗液，5. Ni-NTA洗脫得到的GBP1蛋白，6. 陰離子交換層析純化后GBP1蛋白，M為蛋白標準品；(b) MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜驗證純化的GBP1的分子量；(c) 分子篩層析檢驗GBP1蛋白的聚合狀態(tài).

2.2 分子篩層析檢驗GBP1與熒光蛋白的結(jié)合

分子篩層析能夠利用自身凝膠孔徑的大小將不同分子量的蛋白樣品進行分離，分子量越大越早被洗脫.實驗中用到的Superdex75 10/100層析柱的分離范圍為4～70kD，涵蓋了GBP1與熒光蛋白的分子量.熒光蛋白分子量是GBP1蛋白兩倍左右，GBP1在14mL被洗脫，熒光蛋白約11mL被洗脫(圖2).若二者存在穩(wěn)定的結(jié)合，GBP1-FP復(fù)合物會早于熒光蛋白被洗脫出來，根據(jù)洗脫位置即可判斷二者間是否存在結(jié)合.如圖2(a～c)所示，GBP1與sfGFP、YPet和CyPet以摩爾比1∶1混合樣品，會在11mL被洗脫，早于熒光蛋白的洗脫峰，故重組GBP1蛋白與sfGFP、YPet和CyPet之間存在較強的相互作用.而mDsRed-GBP1蛋白樣品沒有提前洗脫(圖2(d))，洗脫位置與mDsRed一致，故與mDsRed無結(jié)合.

圖2 分子篩層析檢測GBP1蛋白與幾種熒光蛋白的結(jié)合能力Fig.2 Verify the binding of GBP1 to fluorescent proteins by size exclusive chromatography(a) GBP1與sfGFP(綠色)的結(jié)合；(b) GBP1與YFP(橘色)的結(jié)合；(c) GBP1與CFP(青色)的結(jié)合；(d) GBP1與RFP(紅色)的結(jié)合；藍線為GBP1，黑線為GBP1-FP復(fù)合物.

2.3 微量熱泳動檢測GBP1與熒光蛋白的結(jié)合能力

微量熱泳動儀通過檢測溫度梯度中熒光分子的遷移，實現(xiàn)對其結(jié)合能力的定量分析.我們的研究中，熒光蛋白自身帶有熒光，無需標記，可直接檢測.表2及圖3總結(jié)了重組GBP1蛋白與不同熒光蛋白的解離常數(shù)，與GBP1結(jié)合能力最強的是EGFP，解離常數(shù)為0.85nmol/L.

圖3 微量熱泳動檢測GBP1蛋白與幾種熒光蛋白的結(jié)合能力Fig.3 Verify the binding of GBP1 to different fluorescent proteins by microscale thermophoresis(a)～(g)為GBP1與熒光蛋白EGFP、sfGFP、YPet、T-Sapphire、CyPet、ZsGreen和mDsRed的結(jié)合曲線.

GBP1與Aequoreavictoria來源的熒光蛋白均結(jié)合，其親和力從高到低依次為： EGFP(0.85nmol/L)>sfGFP(2.29nmol/L)>YPet(3.60nmol/L)>T-Sapphire(139nmol/L)>CyPet(3610nmol/L)，其中GBP1與綠色熒光蛋白(EGFP和sfGFP)的結(jié)合親和力高，與黃色熒光蛋白(YPet)親和力稍弱，與青色或紫外激發(fā)熒光蛋白(T-Sapphire和CyPet)親和力較低；GBP1與紅色熒光蛋白mDsRed及其他來源的綠色熒光蛋白ZsGreen(?？鸝oanthus來源)之間沒有結(jié)合.

2.4 BS3交聯(lián)實驗

我們通過BS3交聯(lián)實驗進一步檢測了GBP1與熒光蛋白的相互作用.根據(jù)GBP1與熒光蛋白濃度比的不同，將交聯(lián)實驗分為3組，具體的濃度見材料與方法部分.實驗結(jié)果(圖4)表明，提高mDsRed的濃度，GBP1與mDsRed之間依然沒有發(fā)生交聯(lián)；GBP1與sfGFP、YPet之間存在著明顯的交聯(lián)現(xiàn)象；GBP1與CyPet之間的交聯(lián)現(xiàn)象相對較弱，與MST的結(jié)果一致.

圖4 交聯(lián)實驗驗證GBP1與不同熒光蛋白的結(jié)合能力差異Fig.4 Verify the binding of GBP1 to different fluorescent proteins by crosslinking experiment1～4、5～8、9～12的GBP1∶FP(摩爾比)分別為1∶1、2∶1、1∶2；G為sfGFP、Y為YPet、C為CyPet、R為mDsRed.

2.5 等溫滴定量熱實驗

我們通過等溫滴定量熱(ITC)實驗進一步驗證了GBP1與熒光蛋白之間相互作用的參數(shù)，結(jié)果如圖5所示.除mDsRed及ZsGreen不與GBP1結(jié)合外，Aequoreavictoria來源的CyPet與GBP1的親和力也較低，無法擬合出結(jié)合曲線.ITC實驗得到的GBP1與熒光蛋白之間的親和力強弱順序與MST結(jié)果一致，但所測得的結(jié)合常數(shù)有些差距，可能是因為ITC測試時，蛋白濃度過高導(dǎo)致聚集，從而使ITC結(jié)果不夠準確，但若降低待測蛋白質(zhì)濃度，則會導(dǎo)致熱量變化過小而無法獲得良好信噪比的數(shù)據(jù).

圖5 等溫滴定量熱實驗檢測GBP1與不同熒光蛋白相互作用的結(jié)合能力和動力學(xué)參數(shù)Fig.5 Verify the binding of GBP1 to different fluorescent proteins by isothermal titration calorimetry(a) GBP1 to EGFP： n=1.47±0.29,K=(1.77±1.02)×105L/mol,ΔH=-(10.65±0.16)cal/mol,ΔS=24.0cal/(mol·deg); (b) GBP1 to sfGFP： n=1.03±0.02,K=(3.53±2.26)×104L/mol,ΔH=-(8.14±0.23)cal/mol,ΔS=20.8cal/(mol·deg); (c) GBP1 to T-Sapphire： n=1.24±0.27,K=(2.24±1.53)×105L/mol,ΔH=-(10.47±0.16)cal/mol,ΔS=24.4cal/(mol·deg); (d) GBP1 to YPet： n=1.25±0.02,K=(4.69±3.38)×104L/mol,ΔH=-(5.89±0.18)cal/mol,ΔS=21.3cal/(mol·deg).

3 討 論

本項研究通過優(yōu)化密碼子、選用高表達原核載體、優(yōu)化表達條件等方法，大量純化得到重組GBP1蛋白，建立了簡單高效且易重復(fù)的針對熒光蛋白納米抗體的技術(shù)流程.同時，我們測定了GBP1和7種不同熒光蛋白之間相互作用的強度.以上研究為將來進一步開展通過納米抗體操縱熒光蛋白的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，明確了相關(guān)應(yīng)用針對不同熒光蛋白的適用范圍和合適濃度.我們正在嘗試將GBP1交聯(lián)到層析介質(zhì)，利用GBP1與GFP的特異性結(jié)合，對已建立的可視化GFP細胞或動物模型進行操縱，通過GBP1獲取與GFP融合的靶標蛋白質(zhì)復(fù)合物進行純化與鑒定，從而加深對相關(guān)靶標蛋白的功能理解.另外，GBP1可與一系列工具酶進行融合表達，利用GBP1與GFP的特異性相互作用，可在實時觀測GFP的基礎(chǔ)上，在體內(nèi)實時通過這些工具酶對GFP融合的靶蛋白進行操縱.