朱曉萍 顏毛毛 權(quán)海峰 檀利軍 張慎 李慧

【摘 要】本研究以檸檬酸發(fā)酵廢渣為原料，選提取溫度、鹽酸濃度、提取時間、料液比為考察因素，以提取率作為考察指標(biāo)，進行單因素試驗，再利用正交試驗法研究制備氨基葡萄糖鹽酸鹽工藝的最佳提取條件。研究表明：25%鹽酸，廢渣與鹽酸料液比1：2，85℃下酸解4h，此條件下，氨基葡萄糖鹽酸鹽粗品得率為2.14%，說明該提取工藝實際可行，對檸檬酸廢渣中氨基葡萄糖鹽酸鹽的回收利用具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】檸檬酸發(fā)酵廢渣;氨基葡萄糖鹽酸鹽;酸解;正交試驗

中圖分類號： TQ460.6文獻標(biāo)識碼： A文章編號： 2095-2457（2019）08-0017-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.08.006

【Abstract】In this study， Fermentation residue from citric acid was used as raw material. The investigation factors was chosen as temperature， concentration of hydrochloric acid， time and ratio of material to liquid; The single factor experiment was conducted with the extraction rate as the evaluation index. The optimum extraction conditions for the preparation of glucosamine hydrochloride were studied by orthogonal test. The results showed that 25% hydrochloric acid， the ratio of waste residue to hydrochloric acid was 1：2， and the yield of crude glucosamine hydrochloride was 2.14% under this condition. It shows that the extraction process is practical and feasible， and it is of great significance for the recovery and utilization of glucosamine hydrochloride from citric acid waste residue.

【Key words】Citric acid fermentation residue; Glucosamine hydrochloride; Acidolysis; Orthogonal test

氨基葡萄糖，又稱氨糖，其常以N-乙酰基衍生物的形式存在于微生物，動物中。氨糖的化合物常以鹽酸鹽、硫酸鹽和N-乙酰氨基葡萄糖的形式存在[1]。氨基葡萄糖鹽酸鹽（Glucosamine Hydrochloride，GAH）是甲殼素的一種衍生物，濃鹽酸環(huán)境中，甲殼素可水解生成GAH，后經(jīng)中和、脫鹽、脫色等步驟得到白色結(jié)晶。GAH作為化工合成原料，具有促進抗生素藥注射的功能， 也可供糖尿病人作營養(yǎng)助劑，此外還可用于化妝品、飼料添加劑和食品添加劑[2];GAH性質(zhì)穩(wěn)定，具有抗炎、抗氧化、防腐、抗菌、抗腫瘤等多種作用，同時也是合成有關(guān)藥物的重要原料，已經(jīng)在醫(yī)藥、生物技術(shù)、紡織、食品、化妝品和飼料添加劑等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[3-4]。

檸檬酸是一種重要的有機酸，也是世界上廠里較大的有機酸產(chǎn)品之一，目前發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸時常使用黑曲霉。我國是檸檬酸生產(chǎn)大國，從發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸工廠廢渣——黑曲霉菌絲體中提取GAH，不僅可降低成本，且為綜合利用發(fā)酵廢渣提供一條新途徑[5-6]。

本實驗通過酸解提取的方式從檸檬酸廢渣中獲取氨基葡萄糖鹽酸鹽，從而充分利用廢渣，從廢渣中提取一些活性物質(zhì)，改善了污染。為了發(fā)揮更大的用處，提取出更多有用的物質(zhì)，研究溫度，時間，鹽酸濃度，料液比四種因素的影響，根據(jù)單因素試驗，結(jié)合正交設(shè)計軟件，得到優(yōu)化后的提取條件，增加收率，更好地減少浪費和污染[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

主要原料：檸檬酸廢渣（黑曲霉菌絲體）來自安徽豐原集團檸檬酸車間。

標(biāo)準(zhǔn)品：D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品，純度99.18%。

試劑：濃鹽酸，乙醇，磷酸三鈉-四硼酸鈉，乙酰丙酮溶液PDABA（對-二甲胺基苯甲醛）溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 原材料預(yù)處理

用自來水清洗至清洗液pH為7，將檸檬酸廢渣與水的混合物在5000rpm下離心10min進行固液分離，40℃下干燥，干燥至水分低于10%。

1.2.2 氨基葡萄糖鹽酸鹽提取工藝

稱取200g處理后的廢渣（黑曲霉菌絲體），放入提取裝置中，按照一定料液比加入適當(dāng)?shù)柠}酸，于溫度下反應(yīng)一段時間，待反應(yīng)液降至室溫后對反應(yīng)液進行抽濾，除去殘渣（可將濾渣進行二次提取），將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上在60℃下對濾液進行減壓濃縮，再對濃縮液進行降溫結(jié)晶，將所析出的晶體溶解于適量水中，加入一定量的活性炭（5g/L），在60℃下于磁力攪拌器上攪拌1h脫色，脫色完成后對溶液進行抽濾，隨后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對溶液進行濃縮，向濃縮后的溶液中加入95%乙醇使氨基葡萄糖鹽酸鹽析出結(jié)晶，離心、洗滌、干燥后得成品。

1.2.3 氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取105℃干燥至恒重的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽50.0mg，用水定容至100mL配制成0.50mg/mL，再用水稀釋成50.00ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL于25mL具塞比色管中，加蒸餾水至5.00mL。加乙酰丙酮溶液1.0mL具塞混勻，沸水浴30min后冷卻。再加無水乙醇3.0mL、PDABA溶液1.0mL。搖勻，60℃水浴1h，立即冷卻。以空白為對照，用分光光度計在520nm處測定吸收值，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 氨基葡萄糖鹽酸鹽的含量測定[8]

1.3 單因素實驗設(shè)計

1.3.1 反應(yīng)溫度對氨基葡萄糖鹽酸鹽提取率的影響

以料液比為1：3，25%鹽酸，反應(yīng)時間3h，反應(yīng)溫度分別為75℃、80℃、85℃、90℃、95℃，考察反應(yīng)溫度對氨基葡萄糖鹽酸鹽得率的影響。

1.3.2 鹽酸濃度對氨基葡萄糖鹽酸鹽提取率的影響

以料液比為1：3，反應(yīng)溫度為85℃，反應(yīng)時間3h，分別添加濃度為10%、15%、20%、25%、30%的鹽酸溶液，考察鹽酸濃度對氨基葡萄糖鹽酸鹽得率的影響。

1.3.3 提取時間對氨基葡萄糖鹽酸鹽提取率的影響

以料液比為1：3添加25%鹽酸溶液，反應(yīng)溫度為85℃，反應(yīng)時間分別為1h、2h、3h、4h、5h，考察反應(yīng)時間對氨基葡萄糖鹽酸鹽得率的得率的影響。

1.3.4 料液比對氨基葡萄糖鹽酸鹽提取率的影響

設(shè)置反應(yīng)溫度為85℃，反應(yīng)時間3h，加入不同體積的25%濃度鹽酸溶液，使料液比分別為1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3，考察不同料液比對氨基葡萄糖鹽酸鹽得率的得率的影響。

1.4 正交設(shè)計優(yōu)化氨基葡萄糖鹽酸鹽制備工藝

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，影響因素有：酸解溫度，酸解時間，料液比，鹽酸濃度。選取合適的因素水平，使用正交設(shè)計助手3.0進行正交試驗設(shè)計，對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法，統(tǒng)計數(shù)據(jù)得到氨基葡萄糖鹽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=0.0112x-0.0029，R2=0.9999。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酸解溫度對氨基葡萄糖鹽酸鹽提取率的影響

稱取200g處理過的檸檬酸廢渣，按照3：1的比例加入濃度為25%的鹽酸，分別于75℃、80℃、85℃、90℃、95℃下酸解3h，對照圖2可知：85℃下的提取收率最高。

反應(yīng)溫度對酸解、氧化及其他副反應(yīng)的影響比較大。從實驗結(jié)果看，粗品收率隨著提取溫度從75℃到85℃提升時，顯著上升，在85時達到最高，達2.32%。當(dāng)溫度繼續(xù)上升時，粗品收率明顯下降。同時還出現(xiàn)粗品顏色變深的情況，推測由于溫度過高，酸解出的產(chǎn)物遭到破壞而導(dǎo)致[9]。經(jīng)過多批次實驗證明，當(dāng)酸解溫度在90℃以上時，成品脫色較為困難。

2.2.2 鹽酸濃度對氨基葡萄糖鹽酸鹽提取率的影響

稱取200g處理過的檸檬酸廢渣，按照3：1的比例分別加入濃度為10%、15%、20%、25%、30%的鹽酸，在85℃條件下反應(yīng)4h，對照圖3可知：鹽酸濃度為25%時的提取率最高。

鹽酸濃度的影響：鹽酸濃度對檸檬酸廢渣的酸解結(jié)果影響很大。當(dāng)鹽酸濃度過高時，副反應(yīng)增多，炭化現(xiàn)象較為嚴(yán)重，顏色發(fā)黑，同時，隨著時間反應(yīng)的延長，料液粘稠度增加，攪拌困難，造成成品收率和質(zhì)量的下降。在鹽酸濃度低于20%時，氨基葡萄糖鹽酸鹽粗品收率較低，隨著鹽酸濃度的增加，當(dāng)鹽酸濃度為25%時，得到的粗品最為純凈。

2.2.3 提取時間對氨基葡萄糖鹽酸鹽提取率的影響

稱取200g處理過的檸檬酸廢渣，按照3：1的比例加入25%的鹽酸，在85℃條件下，分別進行酸解反應(yīng)2h、3h、4h、5h、6h，對照圖2-4可知：酸解4h時的粗品收率最高。

酸解時間的影響：從實驗結(jié)果來看，在其余條件相同的情況下，酸解反應(yīng)時間為4h是，粗品收率最高，達2.42%。當(dāng)反應(yīng)時間過長時，氨基葡萄糖鹽酸鹽將在繼續(xù)酸解的過程中發(fā)生復(fù)合與再分解反應(yīng)而遭到破壞;而酸解反應(yīng)時間過短時，酸解反應(yīng)不徹底，造成粗品收率偏低[10]。

2.2.4 料液比對氨基葡萄糖鹽酸鹽提取率的影響

稱取200g處理過的檸檬酸廢渣，用25%的鹽酸分別按照1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3的比例，根據(jù)粗品收率得出最高收率為2.55%，對照圖3-4可知：最適的料液比為1：2。

從實驗結(jié)果來看，酸解反應(yīng)需要在一定的鹽酸量下進行，鹽酸的用量太少的話，酸解不徹底，所以收率相應(yīng)也比較低，當(dāng)鹽酸體積與原料比達到2：1時，收率最高，達到2.55%，但當(dāng)鹽酸體積與原料比超過2時，收率未見顯著變化，可見過量鹽酸對收率影響不大。從成本方面考慮，增加鹽酸的用量，成本就會隨之提高，但收率并不增加。增加鹽酸的比例，有利于反應(yīng)的進行，因為鹽酸是作為催化劑成分在反應(yīng)過程中的;作為催化劑的鹽酸，不代表量越高，對反應(yīng)的效果就越好，用量過高，給后面的處理帶來相應(yīng)的困難;但是鹽酸得量又過少，則三角燒瓶內(nèi)的體系粘稠度會增加，不能夠充分反應(yīng)，且容易造成粘壁，增加副反應(yīng)，降低收率[11]。綜上，用25%的鹽酸，料液比為2：1時產(chǎn)率最高，條件最適。

2.3 正交實驗結(jié)果及分析

由表1可知：料液比>提取溫度>提取時間>鹽酸濃度，最適提取條件為A2B3C2D2，即鹽酸濃度為25%、料液比為1：2（g/mL）、提取溫度為85℃、提取時間為4h，在該條件下進行平行試驗，實驗結(jié)果如下表所示。

在正交試驗中得到的最佳提取條件即A2B3C2D2，在表格中為出現(xiàn)該組結(jié)果，因此，設(shè)計驗證實驗，進行三組平行試驗，結(jié)果見表2，在最優(yōu)工藝下進行提取，最終所得粗品得率為2.14±0.06%。

3 討論

本文研究從檸檬酸發(fā)酵廢渣中提取氨基葡萄糖鹽酸鹽，并精致成高純度成品的工藝過程。該項工藝創(chuàng)造性的對原料進行了水洗烘干處理，根據(jù)實驗可以得出相對比較合理的酸解工藝，在精制過程中結(jié)合了納濾膜的使用，制得了純度較高的氨基葡萄糖鹽酸鹽。最為理想的工藝過程為：先用自來水清洗檸檬酸廢渣，使清洗液PH=7時，將檸檬酸廢渣與水的混合物在5000rmp下離心10min進行固液分離，在烘箱中以40℃進行干燥至水分低于10%。配置成25%的鹽酸溶液。稱取200g經(jīng)水洗烘干后的檸檬酸廢渣，浸泡入配置好的鹽酸溶液，在85℃條件下酸解4h。過濾除去濾渣保留濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進行濃縮，濃縮后放入冰箱中冷卻結(jié)晶，得到GAH粗品;粗品再經(jīng)溶解脫色，納濾再濃縮除雜，醇析后得到GAH成品。

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