游思亮

【摘 要】高質量的測序結果必須要有好的測序文庫。本文利用超聲波破碎儀Bioruptor NGS比較了不同的試驗條件對破碎結果的影響，結果表明：對于目的片段為200-300bpDNA的試驗條件為：100uL，濃度50ng/uL，強檔能量，30s On/30s Off ， 破碎9次;目的片段為400-600bp的試驗條件為：100uL，濃度50ng/uL，強檔能量，30s On/30s Off， 破碎5次。

【關鍵詞】高通量測序;超聲波破碎;Bioruptor NGS

中圖分類號： R318.6 文獻標識碼： A文章編號： 2095-2457（2019）08-0034-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.08.013

【Abstract】The good sample library is the prerequisite for high-throughput sequencing results. We compare the results under different conditions with ultrasonic disrupter Bioruptor NGS. The results showed that the optimal sonication conditions for 200-300bp size DNA fragments is 100uL volume， 50ng/uL， high power， 9 cycles of 30 sec On/30 sec Off; for 400-600bp size DNA fragment is 100uL volume， 50ng/uL， high power， 5cycles of 30 sec On/30 sec Off.

【Key words】High-throughput sequencing; Ultrasonic disrupter; Bioruptor NGS

0 引言

高通量測序由于其具有通量高、準確率高、相對成本低等優(yōu)勢，近年來的應用日益廣泛[1]。高通量測序系統(tǒng)可以同時測定上百萬條DNA序列，這使得多個樣本可進行平行比較。但是，樣本文庫的質量在很大程度上將直接決定測序數(shù)據(jù)的質量，進而決定分析結果。因此，在高通量測序過程中，測序文庫的質量控制顯得尤為重要。

高通量測序技術的不斷進步，也促使文庫構建的方法不斷改進，一般來說，文庫構建的主要步驟包括：片段化及篩選特定長度的目的片段;將目的片段轉化成雙鏈DNA;在片段末端連上寡核苷酸接頭;文庫的質控[2]。在制備DNA樣本文庫的時候，DNA樣本的片段化是關鍵的步驟[3]。DNA片段化主要是通過物理方法或酶學來實現(xiàn)的。Head比較了這兩種方法，發(fā)現(xiàn)它們都很有效，不過，與物理方法相比，酶學方法會產(chǎn)生更多的人為插入缺失。

超聲波破碎儀的基本原理是將電能通過換能器轉換為聲能，這種能量通過水而變成密集的小氣泡，隨著氣泡炸裂而產(chǎn)生機械剪切力，對DNA等物質進行打斷。選擇超聲波破碎儀進行高通量測序樣本文庫構建時，應滿足以下幾點：（1）樣本之間不能有交叉污染，被污染的樣本將會對測序數(shù)據(jù)產(chǎn)生很大的影響;（2）需要的樣本量較少，一些臨床樣本，稀有動植物等樣本的基因組DNA的提取量都不是很多，所以破碎儀對樣本的需求量要少;（3）可重復性要高，如果破碎結果重復性差，會導致測序結果的重復性和穩(wěn)定性也會很差 ?；谝陨先c，本文選擇非接觸式超聲波破碎儀Bioruptor NGS，針對目的片段長度100～500bp篩選合適的試驗條件。

1 材料與方法

（1）材料：本實驗所用材料為陸地棉遺傳標準系TM-1，由Kohel博士提供。單株取嫩葉用于DNA的提取，提取方法為CTAB法。

（2）儀器：Bioruptor NGS非接觸式超聲波破碎儀（UCD-600， 比利時Diagenode公司）、電泳儀 Power Pac（Basic Power Supply，美國Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng) ChemiDoc XRS（美國Bio-Rad公司）、2100生物分析儀（美國Agilent公司）、分光光度計One Drop2000（美國Thermo Scientific公司）

2 結果與討論

2.1 總DNA質量檢測

提取的總DNA條帶集中清晰，表明DNA質量完好，沒有出現(xiàn)降解情況，可用于后續(xù)試驗操作。

2.2 DNA濃度的選擇

選取DNA樣本100uL，破碎程序30s On/30s Off，5cycles， 強檔能量，選取濃度梯度10 ng/uL、50ng/uL，500ng/uL破碎基因組DNA，然后使用2100生物分析儀檢測片段大小分布。結果顯示：不同濃度之間的條帶分布沒有明顯的差異，因此，考慮到后續(xù)步驟對樣品的損耗，采用50ng/uL作為最終處理濃度。

2.3 超聲波能量的選擇

選取DNA樣本100uL，濃度50ng/uL，破碎程序30s On/30s Off，10cycles，并分別用弱、中、強三個能量檔次破碎DNA。通過圖片可以看出隨著能量的提高，條帶分布逐漸集中，所以選取強檔能量作為打斷條件。

2.4 間隔時間

選取DNA樣本100uL，濃度50ng/uL，強檔能量，重復10次，分別使用程序30s On/ 30s Off、30s On/ 60s Off 、30s On/ 90s Off，分析間隔時間對破碎效果的影響。通過圖片可以看出：各處理之間在片段分布上沒有明顯差異，說明30s的停頓時間已經(jīng)可以滿足試驗需求，從時間成本考慮，選擇30s On/30s Off作為破碎程序。

2.5 破碎次數(shù)

選取DNA樣本100uL，濃度50ng/uL，強檔能量，30s On/ 30s Off程序，分別破碎了5次、10次、15次，分析破碎次數(shù)對結果的影響。從圖中可以看出：破碎5次時，條帶分散在較大的區(qū)間范圍，10次時，條帶分布基本滿足后續(xù)建庫的要求，進一步設置不同的梯度試驗，針對不同樣本的建庫要求，得到相應的試驗條件。

3 結論

對于高通量測序建庫常用的兩個目的片段范圍200-300bp和400-600bp，采用以下試驗條件。目的長度200-300bp：樣本體積100uL，濃度50ng/uL，強檔能量，30s On/30s Off，破碎9次;目的長度400-600bp：樣本體積100uL，濃度50ng/uL，強檔能量，30s On/30s Off，破碎5次。

【參考文獻】

[1]閆紹鵬，楊瑞華，冷淑嬌，等.高通量測序技術及其在農業(yè)科學研究中的應用[J].中國農學通報，2012，30：171-176.

[2]岳桂東，高強，羅龍海，等.高通量測序技術在動植物研究領域中的應用[J].中國科學：生命科學，2012，02：107-124.

[3]于聘飛，王英，葛芹玉.高通量DNA測序技術及其應用進展[J].南京曉莊學院學報，2010，03：1-5.