番茄抗TYLCV分子標(biāo)記輔助聚合育種

侯富恩 郝科星 張濤 蘇東濤 王銘

摘 要： 為了培育對(duì)TYLCV（Tomato yellow leaf curl virus）抗性穩(wěn)定持久、園藝性狀優(yōu)良的番茄品種，以分別含有Ty-1、Ty-2、Ty-3的3個(gè)抗源材料‘TY52‘CLN2777A‘R1164為供體親本，2個(gè)園藝性狀優(yōu)良的不含抗病基因的育種材料‘TMX255-1‘TMX255-5為受體親本，通過(guò)雜交和多代回交自交，同時(shí)利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)、苗期接種技術(shù)和農(nóng)藝性狀觀察對(duì)后代進(jìn)行篩選，將Ty-1與Ty-2導(dǎo)入并聚合到‘TMX255-1，Ty-1與Ty-3導(dǎo)入并聚合到‘TMX255-5，最終獲得2份聚合了不同抗病基因的株系，分別命名為‘TY1-2‘TY1-3，并對(duì)其進(jìn)行了抗性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，2份株系對(duì)TYLCV整個(gè)生育期在田間都表現(xiàn)抗病，且園藝性狀優(yōu)良穩(wěn)定，可以作為自交系應(yīng)用于抗病育種中。

關(guān)鍵詞： 番茄； TYLCV； 分子標(biāo)記； 聚合育種

Abstracts： In order to breed tomato varieties with excellent resistance to TYLCV （Tomato yellow leaf curl virus） and good horticultural traits， two TYLCV susceptible tomato lines ‘TMX255-1，‘TMX255-5 were used as recipient parents to cross and backcross with the three donor parents ‘TY52，‘CLN2777A，‘R1164，which contained Ty-1，Ty-2，Ty-3，respectively. Molecular marker-assisted selection（MAS）， seedling inoculation identification and observation of agriculture characters were used in each backcross and self-cross progeny selection， and two pyramided lines were obtained which named ‘TY1-2 and ‘TY1-3. The evaluation of resistence level of two pyramided lines showed that the pyramided lines which carried both resistance genes were resistant to tomato leaf curl disease throughout its life cycle in the field and exhibited excellent horticultural traits. So the lines could be used as inbred lines in resistance breeding.

Key words： Tomato； TYLCV（Tomato yellow leaf curl virus）； Molecular marker； Pyramid

番茄黃化曲葉?。═omato yellow leaf curl disease，TYLCD）是目前我國(guó)番茄生產(chǎn)上的重要病害之一，植株感病后會(huì)表現(xiàn)出葉片卷曲、黃化、生長(zhǎng)停滯等現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致大面積絕收[1-6]。導(dǎo)致該病發(fā)生的病原為番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV），該病毒屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），是一類(lèi)具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA植物病毒，其基因組重組發(fā)生率和變異頻率較高[7]。利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)聚合多個(gè)抗TYLCV基因，是培育具有持久抗性品種最有效的策略[8]。因此，筆者結(jié)合苗期接種鑒定、分子標(biāo)記輔助選擇和田間性狀觀察，初步研究番茄不同抗TYLCV基因聚合后抗性表現(xiàn)的差異，建立番茄抗TYLCV聚合育種的分子標(biāo)記輔助選擇體系，以獲得抗性高且不再分離同時(shí)性狀優(yōu)良的自交系，為番茄優(yōu)質(zhì)、抗病育種創(chuàng)制新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

3份含有TYLCV抗性基因材料‘TY52‘CLN2777A‘R1164（分別含有Ty-1、Ty-2、Ty-3），其中‘TY52‘CLN2777A由亞洲蔬菜研究發(fā)展中心提供，‘R1164由雜交品種的分離后代選育而成。2份受體親本材料‘TMX255-1‘TMX255-5（不含TYLCV抗性基因），是由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所自主選育的純合自交系。感病對(duì)照為‘Moneymaker，該品種在山西地區(qū)對(duì)TYLCV表現(xiàn)為高感。

1.2 接種鑒定

病毒接種采用大田自然接種法，試驗(yàn)于2012—2017年在山西省農(nóng)科院榆次東陽(yáng)溫室試驗(yàn)基地進(jìn)行，1年2代。6—10月份為煙粉虱發(fā)病高峰季節(jié)，這期間在發(fā)病嚴(yán)重的溫室內(nèi)育苗，使植株在苗期感染TYLCV，同時(shí)控制蟲(chóng)口數(shù)量，7～10 d噴1次殺蟲(chóng)藥，以免對(duì)植株造成傷害。定植時(shí)選擇TYLCV發(fā)病嚴(yán)重的溫室，同樣也需注意蟲(chóng)口數(shù)量，定期噴施殺蟲(chóng)劑。參照L. Mejía和R. E. Teni等[9]定植30 d和60 d后進(jìn)行病情調(diào)查，根據(jù)發(fā)病情況對(duì)所有植株病情嚴(yán)重指數(shù)（disease severity index，DSI）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果按照發(fā)病嚴(yán)重程度分為0～4級(jí)：0級(jí)，無(wú)任何感病癥狀；1級(jí)，頂端葉邊緣黃化；2級(jí)，頂端小葉變黃并發(fā)生輕微卷曲；3級(jí)，大范圍葉片變黃，卷曲嚴(yán)重，植株生長(zhǎng)量??；4級(jí)，癥狀非常嚴(yán)重，植株矮化，基本停止生長(zhǎng)[10]。

1.3 抗TYLCV基因聚合過(guò)程

2012年種植所有親本材料‘TMX255-1‘TMX255-5‘TY52‘CLN2777A‘R1164，按計(jì)劃配制雜交組合，獲得（‘TMX255-1בTY52）F1，（‘TMX255-1בCLN2777A）F1，（‘TMX255-5בTY52）F1，（‘TMX255-5בR1164）F1，2012年下半年開(kāi)始，將獲得的F1分別回交，每一代都利用分子標(biāo)記檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合農(nóng)藝性狀觀察，在回交后代中篩選含有抗病基因的優(yōu)良單株留種并繼續(xù)回交。在連續(xù)回交6代后，遺傳背景基本恢復(fù)，2015年下半年將2個(gè)方向的回交后代進(jìn)行雜交，從雜交后代中篩選同時(shí)含有2個(gè)抗病基因的單株自交并留種，再?gòu)淖越缓蟠泻Y選同時(shí)含有2個(gè)抗病基因，且純合的單株進(jìn)行留種，并對(duì)后代進(jìn)行性狀調(diào)查，篩選性狀與輪回親本一致的植株留種，繼續(xù)自交留種，最終于2017年下半年獲得2份分別聚合了Ty-1和Ty-2，Ty-1和Ty-3，遺傳背景分別與輪回親本‘TMX255-1‘TMX255-5基本一致，且高抗TYLCV的番茄品系，分別命名為‘TY1-2‘TY1-3。

1.4 分子標(biāo)記檢測(cè)

用于檢測(cè)與抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3的分子標(biāo)記均為共顯性SCAR標(biāo)記，分別為P6-6、T0302、P6-25[11-13]；所有引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系：模板1.5 μL，Taq PCR Master Mix 5 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 2.5 μL；反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，退火53 ℃[57 ℃（T0302）]30 s，72 ℃ 45 s ，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 園藝性狀指標(biāo)調(diào)查

評(píng)價(jià)材料遺傳背景的主要農(nóng)藝性狀包括：下胚軸顏色、生長(zhǎng)習(xí)性、莖葉茸毛、葉片類(lèi)型、葉片形狀、葉色、葉裂刻、花序類(lèi)型、花柱長(zhǎng)度、花柱形狀、花色、花梗離層、成熟前果色、成熟果色、果面棱溝、果面茸毛、果頂形狀、果肩、商品果果形指數(shù)、果形、果肉顏色、胎座膠狀物質(zhì)顏色、心室數(shù)、可溶性固形物含量、單果質(zhì)量、種子千粒重。其中，莖葉性狀指標(biāo)在第3穗果成熟期調(diào)查統(tǒng)計(jì)，花序性狀指標(biāo)在第2花序盛開(kāi)期調(diào)查，果實(shí)性狀指標(biāo)在第2穗果成熟期進(jìn)行調(diào)查，各指標(biāo)采用5個(gè)果實(shí)的平均值；利用糖度計(jì)測(cè)量果實(shí)的可溶性固形物含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010及SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同材料田間煙粉虱接種鑒定后的抗病性表現(xiàn)

單個(gè)不同抗病基因及不同抗病基因聚合植株的病級(jí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2，定植30 d后進(jìn)行病情調(diào)查，只有感病材料‘TMX255-1‘TMX255-5和對(duì)照材料出現(xiàn)病癥，單基因抗源材料除了‘TY52（只含有Ty-1）有輕微感病癥狀外，其余單基因抗源材料和聚合基因材料都無(wú)發(fā)病癥狀。定植60 d后，感病材料‘TMX255-1‘TMX255-5和對(duì)照材料均表現(xiàn)為嚴(yán)重感病，植株生長(zhǎng)停滯，葉片嚴(yán)重黃化卷縮；單基因抗源材料‘TY52表現(xiàn)輕微感病，新葉表面輕微黃化，無(wú)皺縮；其余材料均無(wú)明顯感病癥狀，均表現(xiàn)為高抗。結(jié)合苗期接種鑒定與分子標(biāo)記檢測(cè)，選擇表現(xiàn)高抗且分別含有抗病基因組合Ty-1和Ty-2，Ty-1和Ty-3的聚合單株自交留種，再自交，獲得2份聚合材料。獲得的2份聚合株系整個(gè)生育期都表現(xiàn)高抗TYLCV，且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定一致，可以作為自交系用于育種工作。

2.2 聚合后代主要農(nóng)藝性狀觀察

通過(guò)田間農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)調(diào)查，結(jié)果顯示聚合自交系‘TY1-2和‘TY1-3在葉、花、果等農(nóng)藝性狀方面與受體親本已無(wú)顯著差異（表3）。

2.3 分子標(biāo)記鑒定聚合材料抗性基因

利用與抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3連鎖的分子標(biāo)記P6-6、T0302、P6-25篩選‘TY1-2‘TY1-3的聚合單株，其中含有Ty-1和Ty-2的‘TY1-2聚合單株能擴(kuò)增出530 bp和900 bp的特異片段，含有Ty-1和Ty-3的‘TY1-3聚合單株能擴(kuò)增出530 bp和450 bp的特異片段。從‘TY1-2的148個(gè)單株中隨機(jī)抽取7株進(jìn)行抗病基因Ty-1（圖1-A）和Ty-2（圖1-B）的分子標(biāo)記檢測(cè)。從‘TY1-3的92個(gè)單株中隨機(jī)抽取7株進(jìn)行抗病基因Ty-1（圖1-C）和Ty-3（圖1-D）的分子標(biāo)記檢測(cè)。結(jié)果顯示，抽取的單株中均分別含有Ty-1和Ty-2、Ty-1和Ty-3抗病基因。

3 討 論

3.1 抗性基因聚合對(duì)后代抗病性的影響

通過(guò)對(duì)含有不同單個(gè)抗病基因的材料和2份聚合材料‘TY1-2‘TY1-3進(jìn)行田間TYLCV接種鑒定，結(jié)果表明，聚合了多個(gè)抗病基因的材料抗病性顯著強(qiáng)于只含有單個(gè)抗病基因的材料，同時(shí)也證實(shí)P6-6、T0302、P6-25分子標(biāo)記輔助選擇聚合育種的有效性。

3.2 分子標(biāo)記在聚合育種中的作用

用傳統(tǒng)的育種方法要實(shí)現(xiàn)將多個(gè)抗性基因聚合在一起是相當(dāng)困難的，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)工，而且很難對(duì)多個(gè)抗性基因進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。采用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因直接選擇，可以很大程度上減少選擇的盲目性，提高育種效率，加快育種進(jìn)程。

本研究中應(yīng)用的3個(gè)分子標(biāo)記，P6-6、T0302和P6-25，在應(yīng)用過(guò)程中，擴(kuò)增條帶穩(wěn)定，但遺傳距離較大，在后代選擇過(guò)程中，P6-6的準(zhǔn)確率為84.5%，T0302的準(zhǔn)確率為89.8%，P6-25的準(zhǔn)確率為83.2%。所以分子標(biāo)記輔助選擇必須與田間抗性鑒定相結(jié)合，才能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，不能單純依靠分子標(biāo)記進(jìn)行篩選。此外，還需要繼續(xù)開(kāi)發(fā)新的更加緊密連鎖的分子標(biāo)記，以期進(jìn)一步提高分子標(biāo)記選擇的準(zhǔn)確率。

3.3 回交后代的選擇

關(guān)于回交后代選擇的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有性狀指標(biāo)和分子標(biāo)記檢測(cè)指標(biāo)[14]。筆者選用綜合性狀優(yōu)良的番茄自交系‘TMX255-1和‘TMX255-5作為抗性基因受體親本，先分別單向回交6代，同時(shí)每一代都應(yīng)用分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行選擇，使回交后代的遺傳背景恢復(fù)至近于輪回親本，且同時(shí)含有相應(yīng)抗病基因。當(dāng)遺傳背景得到一定程度恢復(fù)后，再將2個(gè)方向的回交后代雜交，從聚合雜交后代中獲得遺傳背景近于輪回親本的抗病植株。在定向轉(zhuǎn)移抗病基因Ty-1、Ty-2時(shí)，其供體親本‘TY52‘CLN2777A與受體親本‘TMX255-1和‘TMX255-5間的遺傳背景差異較大，回交后代性狀向輪回親本恢復(fù)的速度相對(duì)較慢，其BC6 世代綜合性狀與輪回親本仍有一定差異。下一步計(jì)劃篩選出多態(tài)性好的分子標(biāo)記，應(yīng)用于回交后代性狀的恢復(fù)過(guò)程中，一定程度上提高回交后代的遺傳背景恢復(fù)速率。

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