黃子彧，鐘 軍，宋 浩，黃德文，戴 彬，戴林建*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

【研究意義】通過(guò)單倍體進(jìn)行良種選育，其中由隱性基因控制的性狀,由于沒(méi)有顯性基因的掩蓋而容易顯現(xiàn)。單倍體植株經(jīng)染色體加倍后,在一個(gè)世代中即可出現(xiàn)純合的二倍體，從中選出的優(yōu)良純合系后代不分離,可縮短育種年限。單倍體育種如能進(jìn)一步提高誘導(dǎo)頻率并與雜交育種等相結(jié)合應(yīng)用，則在作物品種改良上的作用將更顯著。組織培養(yǎng)是單倍體育種中應(yīng)用最廣的方式，通過(guò)組織培養(yǎng)產(chǎn)生幼苗有兩大途徑：一是通過(guò)愈傷組織的誘導(dǎo)分化，二是通過(guò)胚狀體誘導(dǎo)。采用胚狀體誘導(dǎo)能提高幼苗產(chǎn)生速率，且穩(wěn)定性高，從而節(jié)省了資源，提高了效率[1-7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】胚狀體誘導(dǎo)頻率受多個(gè)因素的影響，如基因型、培養(yǎng)基、預(yù)處理、培養(yǎng)材料及條件等[6-13]。陳春艷等人認(rèn)為4 ℃低溫預(yù)處理48 h能顯著提高花藥胚狀體的誘導(dǎo)率[14]。賈永炯的研究發(fā)現(xiàn)在含0.4～0.8 mg/L 2,4-D的Nitsch培養(yǎng)基上,能提高胚狀體發(fā)生頻率[15]。王仲慧[16]、李婷婷[17]等人的研究說(shuō)明基因型是影響誘導(dǎo)率的一個(gè)重要因素。潘莉等人的研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度及光照強(qiáng)度等對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率也會(huì)產(chǎn)生影響[18]。李春玲[13]與王立浩[19]等人對(duì)培養(yǎng)基中添加的碳源及其濃度進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 %的蔗糖對(duì)花藥的誘導(dǎo)率最高?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人的試驗(yàn)多是研究某一或幾個(gè)因素對(duì)花藥或葉片誘導(dǎo)頻率的影響，鑒于此，作者在前人實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)花藥與葉片作為培養(yǎng)材料在各影響因素下的誘導(dǎo)能力進(jìn)行比較?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】著重對(duì)花藥與葉片各自最適生長(zhǎng)激素與細(xì)胞分裂素的比例及濃度進(jìn)行探討，以期為提升煙草胚狀體誘導(dǎo)效率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的煙草雜交品種為鉀高效品系與其他抗黑脛病烤煙品種的雜交子一代，雜交組合為①♂凈葉黃×♀HKDN-5，②♂HKDN-5×♀革新3號(hào)。所有雜交組合于2017年3月移栽至湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地，采用常規(guī)田間管理方法，2017年5月下旬開(kāi)始現(xiàn)蕾。

1.2 基本培養(yǎng)基

花藥：1/2 MS + 0.1 mg/L IAA + 0.25 mg/L 6-BA + 3 % 蔗糖 + 0.7 % 瓊脂， pH 5.8。

葉片：1/2 MS + 0.1 mg/L IAA + 0.5 mg/L 6-BA + 3 % 蔗糖 + 0.7 % 瓊脂， pH 5.8。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.3.1 無(wú)菌材料獲得 ①花藥：晴天摘取花冠與花萼等長(zhǎng)或花冠超出部分不超過(guò)花萼1/3的花蕾，4 ℃冰箱中預(yù)處理2 d后，將花蕾放入超凈臺(tái)進(jìn)行消毒。消毒步驟為：先用無(wú)菌水沖洗2次；接著用75 %酒精漂洗30 s，后用無(wú)菌水沖洗3次；再用20 % NaClO和少量吐溫20浸泡15 min，后用無(wú)菌水漂洗4次，最后置于無(wú)菌濾紙上除濕。用鑷子撥開(kāi)花冠，小心取出花藥。②葉片：采用花藥離體培養(yǎng)產(chǎn)生的幼苗，經(jīng)單倍體鑒定后，取上部幼嫩的1～3片葉，切割成0.5 cm×0.5 cm的小塊。

1.3.2 基因型與外源激素添加量對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響 在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入不同濃度的外源激素IAA與6-BA，每種激素均設(shè)0、0.125、0.25、0.5、1.0 mg/L 5個(gè)水平。將2種雜交子一代的花藥和葉片在各激素水平組合下分別進(jìn)行培養(yǎng)，每種材料均有25個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5次，每個(gè)培養(yǎng)皿接種25顆，然后放入25 ℃，光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間12 h/d的光照培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 其他因素對(duì)煙草胚狀體誘導(dǎo)的影響 ①光照。采用品種1的花藥和葉片作為試驗(yàn)材料，分別在2000 lx，12 h/d的光照、暗處理10 d后移入光照條件與無(wú)光條件3種情況下分別離體培養(yǎng)，每組重復(fù)10次，其他條件保持一致。②接種密度。采用品種1的花藥和葉片，分別接種10、15、20、25、30、35、40顆于90 mm的培養(yǎng)皿中，各處理均重復(fù)5次，培養(yǎng)基條件與光照保持一致。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)方法 自花藥接種后3 d觀察其污染情況，及時(shí)清除污染的培養(yǎng)皿，在上述各實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)葉片胚狀體的誘導(dǎo)率，45 d后統(tǒng)計(jì)花藥胚狀體的誘導(dǎo)率。

花藥(葉片)胚狀體誘導(dǎo)率=

愈傷組織誘導(dǎo)率=

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體與基因型對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率的影響

由圖1和表1可知，基因型是影響胚狀體誘導(dǎo)率的重要因素之一，不同基因型之間花藥胚狀體的誘導(dǎo)率有極顯著的差異，在本試驗(yàn)中品種1的花藥胚狀體誘導(dǎo)率達(dá)34 %，品種2誘導(dǎo)率僅為15 %，相差19 %。而二者的葉片胚狀體誘導(dǎo)率分別為24 %與17 %，相差雖只有7 %，但依然有顯著差異。對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)則不同，2種基因型之間的誘導(dǎo)率無(wú)較大差異。但同一基因型下，花藥與葉片之間，無(wú)論愈傷組織還是胚狀體，均有極顯著的差別，說(shuō)明不同外植體和誘導(dǎo)率之間有更緊密的聯(lián)系。

表1 不同基因型對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

注：不同大寫(xiě)字母為差異達(dá)顯著水平(P<0.01)，小寫(xiě)字母為差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，下同。

Note:The uppercase letter indicated significant difference at 0. 01 level. Lowercase letter indicated significant difference at 0. 05 level. The same as below．

1.♂凈葉黃×♀HKDN-5，2.♂HKDN-5×♀革新3號(hào)1.♂Jing ye huang×♀HKDN-5，2.♂HKDN-5×♀Ge xin No.3圖1 不同基因型的花藥和葉片誘導(dǎo)率的差異Fig.1 Differences in embryoid induction rate result from different genotypes

表2 不同激素濃度對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

2.2 培養(yǎng)基成分對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

2.2.1 外源激素濃度對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響 如表2所示，外源激素濃度對(duì)煙草胚狀體誘導(dǎo)有極顯著的影響。不加激素有約8 %的外植體能被誘導(dǎo)出胚狀體并形成小苗，加入0.125～0.5 mg/L的外源激素后，能使胚狀體的誘導(dǎo)率普遍提升，提升幅度在5 %～38 %，加入1 mg/L的激素時(shí)，胚狀體的誘導(dǎo)率較不加激素時(shí)無(wú)明顯提升作用；而愈傷組織的誘導(dǎo)率卻有較大提升，最大提升了43 %。對(duì)于花藥培養(yǎng)而言，25組處理中共有6組產(chǎn)生了愈傷組織，以添加0.25 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA為界，在此濃度下，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率為5 %，在0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA濃度條件下愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到34 %。當(dāng)生長(zhǎng)素濃度與細(xì)胞分裂素濃度出現(xiàn)極大差異或僅添加其中1種激素時(shí)，花藥依然傾向于開(kāi)裂后形成胚狀體，而非愈傷組織。對(duì)于體細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，25組處理均產(chǎn)生了愈傷組織,也均有胚狀體產(chǎn)生。且2種激素添加濃度相差越大，越傾向產(chǎn)生愈傷組織。

表3 不同激素比例對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

2.2.2 不同激素比例對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率的影響 由表3可知，不同激素比例之間的誘導(dǎo)率差異變化更加顯著，IAA與6-BA的比例為1∶1或1∶2時(shí)，花藥胚狀體誘導(dǎo)率明顯高于其他比例，品種1的誘導(dǎo)率最大可達(dá)54 %。當(dāng)二者比例超過(guò)1∶4時(shí)，誘導(dǎo)率極顯著下降，平均誘導(dǎo)率下降至10 %～21 %。對(duì)于葉片而言，當(dāng)激素比例為1∶2或1∶4時(shí)，平均出胚率顯著高于其他比例，最大能達(dá)到41 %。且不同品種間的最適比例也有差別，品種1的花藥在IAA：6-BA為1∶2時(shí)具最高胚狀體誘導(dǎo)率，而品種2的花藥最適激素比例是1∶1。說(shuō)明外源激素添加比例也對(duì)胚狀體誘導(dǎo)有著顯著影響，且與品種之間存在相互聯(lián)系。

2.3 其他因素對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率的影響

2.3.1 光照對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響 通過(guò)光照與黑暗條件下誘導(dǎo)率差異的對(duì)比實(shí)驗(yàn)(圖2)發(fā)現(xiàn)，花藥胚狀體在光照條件下誘導(dǎo)率為40 %，無(wú)光條件下誘導(dǎo)率為36 %，誘導(dǎo)10 d后將黑暗中的一部分移入光照條件下，誘導(dǎo)率為48 %。說(shuō)明對(duì)花藥而言，進(jìn)行一段時(shí)間的暗處理可以在一定程度上刺激花藥胚狀體的萌發(fā)。葉片在光照條件下的胚狀體誘導(dǎo)率為36 %，無(wú)光條件下誘導(dǎo)率為48 %，誘導(dǎo)10 d后將黑暗中的一部分移入光照條件下，誘導(dǎo)率為58 %，說(shuō)明無(wú)論是10 d暗處理，還是進(jìn)行20 d的暗培養(yǎng)均可提高葉片胚狀體的萌發(fā)，但胚狀體萌發(fā)后若不及時(shí)移入光照環(huán)境下，對(duì)幼苗的生長(zhǎng)不利，易形成白化苗，植株瘦弱，生長(zhǎng)速度大幅減緩。

2.3.2 接種密度對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響 圖3和表4表明，花藥胚狀體的誘導(dǎo)率并不會(huì)隨著密度的提高而出現(xiàn)明顯增加。但隨著密度的提高，誘導(dǎo)出胚狀體的花藥在總數(shù)上是低密度的1.2倍，提高花藥密度有利于節(jié)約資源與成本。與花藥培養(yǎng)不同的是，對(duì)于體細(xì)胞而言，隨著接種密度增大，胚狀體的誘導(dǎo)率有上升趨勢(shì)。當(dāng)接種密度上升到每培養(yǎng)皿40顆時(shí)，胚狀體的誘導(dǎo)略有下降，說(shuō)明密度過(guò)高也會(huì)抑制胚狀體的產(chǎn)生。

表4 密度對(duì)煙草體外培養(yǎng)的影響

3 討 論

對(duì)煙草胚狀體誘導(dǎo)效率的影響因素進(jìn)行研究，結(jié)果表明基因型是影響煙草誘導(dǎo)出胚狀體的重要因素之一，基因型與外源激素間存在相互聯(lián)系，不同基因型的胚狀體萌發(fā)率有極大的差別。材料也是影響胚狀體誘導(dǎo)效率的因素[20]，花藥與體細(xì)胞之間，花藥的誘導(dǎo)效率高，數(shù)量多，一次性能獲得大量胚狀體，有利于優(yōu)良性狀的表達(dá)。但采用體細(xì)胞作為誘導(dǎo)材料時(shí)不受時(shí)間控制，易于獲得，節(jié)省時(shí)間成本，且在適宜的條件下也有較高的誘導(dǎo)效率。

激素是調(diào)控植物生長(zhǎng)的重要物質(zhì)[21]。本試驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明，添加0.1～0.5 mg/L IAA與0.25～0.5 mg/L的 6-BA的培養(yǎng)基上，胚狀體誘導(dǎo)頻率較不添加激素時(shí)，能得到顯著提高。但激素濃度升高到一定程度后(1 mg/L)反而會(huì)使花藥和葉片更加傾向形成愈傷組織，而非形成胚狀體，這在花藥胚狀體的誘導(dǎo)中更為明顯。這與慕平利[22]的研究結(jié)果一致。激素的比例也會(huì)對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)率造成影響，不同基因型之間的最適比例并不相同，當(dāng)生長(zhǎng)激素與細(xì)胞分裂素處于1∶2或1∶1時(shí)，花藥萌發(fā)率最高，當(dāng)二者比例為1∶4時(shí)，葉片胚狀體誘導(dǎo)率最高。綜上所述，采取較低的外源激素濃度能避免形成愈傷組織，提升胚狀體的誘導(dǎo)可能性，保持其適當(dāng)?shù)谋壤芴岣攉@得的效率。

除此之外，接種密度也會(huì)使誘導(dǎo)率產(chǎn)生差異，孫夕等[23]的研究表明，在一定范圍內(nèi)花藥密度與誘導(dǎo)率呈正相關(guān)，超過(guò)一定范圍則無(wú)較大影響。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明花藥密度與誘導(dǎo)率之間并無(wú)明顯正相關(guān)，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是花藥的接種密度還沒(méi)有到達(dá)臨界值，花藥間的間距仍然較寬，并未出現(xiàn)群體效應(yīng)；或者花藥密度增大雖誘發(fā)了群體效應(yīng)但培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)水分供給不足，導(dǎo)致密度大的處理本應(yīng)萌發(fā)出胚狀體的花藥停止了萌發(fā)，致使最后的萌發(fā)總數(shù)仍然不高。但接種密度小雖然誘導(dǎo)效率不減，卻并不利于節(jié)省空間與培養(yǎng)基原料。而體細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在一定程度上接種密度增大能提高胚狀體的誘導(dǎo)率，且當(dāng)每個(gè)培養(yǎng)皿接種達(dá)到40個(gè)時(shí)胚狀體的誘導(dǎo)率即有所下降。

環(huán)境因素也是影響胚狀體誘導(dǎo)的重要因素之一。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，光照不是花藥或體細(xì)胞萌發(fā)的必要條件，暗培養(yǎng)或是適當(dāng)暗培養(yǎng)一段時(shí)間后轉(zhuǎn)移至光照條件下，更有利于胚狀體的誘導(dǎo)。但是光照也能刺激一些花藥或是體細(xì)胞萌發(fā)成胚狀體，且要把握好移入光照的時(shí)間，避免產(chǎn)生白化苗。

4 結(jié) 論

使胚狀體誘導(dǎo)效率提高主要體現(xiàn)在保持較高的胚狀體萌發(fā)率的情況下，節(jié)省時(shí)間與成本。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明采用體細(xì)胞進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)，培養(yǎng)基采用1/2 MS+0.125 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA，每培養(yǎng)皿接種35顆材料，可先在黑暗或弱光條件下培養(yǎng)7～10 d后，再移入光照下培養(yǎng)是高效誘導(dǎo)胚狀體的最適條件。