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      Tie2基因?qū){米金顆粒進入牙周組織的影響

      2019-05-14 08:31:54李許演李卓權(quán)
      同濟大學學報(醫(yī)學版) 2019年2期
      關(guān)鍵詞:牙周膜牙周組織轉(zhuǎn)基因

      李 辰, 李許演, 周 敏, 李卓權(quán), 時 函

      (1. 同濟大學口腔醫(yī)學院及附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科,上海市牙組織修復與再生工程技術(shù)研究中心,上海 200072;2. 同濟大學口腔醫(yī)學院及附屬口腔醫(yī)院牙周病科,上海市牙組織修復與再生工程技術(shù)研究中心,上海 200072;3. 同濟大學醫(yī)學院生物醫(yī)學工程與納米科學研究院,上海 200092; 4. 同濟大學口腔醫(yī)學院及附屬口腔醫(yī)院口腔 正畸科,上海市牙組織修復與再生工程技術(shù)研究中心,上海 200072)

      納米金作為一種生物相容性好、細胞毒性低、抗氧化性強以及能與多種生物大分子結(jié)合且不影響其生物學特性的納米材料,近十幾年里在生命科學及生物醫(yī)學中受到廣泛關(guān)注[1]。近年來,研究顯示納米金顆粒(GNPs)能作用于細胞,影響其增殖和分化等生理進程。研究[2]表明,GNPs對人牙周膜細胞增殖具有促進作用,但這種效應跟GNPs的粒徑大小和作用濃度有關(guān);粒徑60nm、濃度56μmol/L的GNPs在體外能有效促進人牙周膜干細胞的增殖,并且對其多向分化潛能無明顯改變??梢灶A見GNPs在牙周組織工程中有一定的應用前景。

      牙周血管系統(tǒng)的重要性在血管生成、組織再生等生理過程和牙齦增生、牙齦萎縮以及組織愈合等病理過程中已經(jīng)得到公認[3]。內(nèi)皮細胞特異性酪氨酸激酶受體-2(tunica interna endothelial cell kinase 2, Tie2)在調(diào)節(jié)血管生成的信息通路以及維持組織血管通透性中發(fā)揮重要作用[4]。本研究應用Tie2-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠來研究Tie2基因高表達對不同粒徑GNPs進入牙周組織及積累情況的影響,為今后GNPs應用于牙周組織工程提供一定的理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      Tie2-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠以及與轉(zhuǎn)基因同品系的BALB/c小鼠購于南京大學模式動物中心;納米金顆粒(直徑20、40、60、80nm)購于BBI公司;實時熒光定量PCR儀(ABI7300)購自ABI公司;化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon5200)購自上海天能公司;冰凍切片機(CM 1850)購自德國萊卡公司;電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES)(P-4010)購自日本日立公司;TRIzol購自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司;PowerSYBR Green預混液購自Applied Biosystems公司;Tie2抗體(ab24859)、GAPDH抗體(ab9485)購自Abcam公司;HRP二抗試劑盒購和ECL試劑盒購于碧云天公司;Western印跡法檢測相關(guān)試劑購買于生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑購于國藥集團化學試劑(上海)有限公司。

      1.2 方法

      1.2.1 實時定量PCR檢測Tie2 mRNA表達 取正常小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠牙周組織(牙齦和牙周膜)各100mg,勻漿,加入TRIzol抽提組織RNA,分光光度計檢測RNA質(zhì)量濃度和完整性。按照試劑盒進行實時定量PCR操作。Tie2引物(PMID: 20463289),正義鏈: 5′-GATTTTGGATTGTCCCG-AGGTCAAG-3′;反義鏈: 5′-CACCAATATCTGGG-CAAATGATGG-3′;GAPDH引物,正義鏈: 5′-GGTG-AAGGTCGGTGTGAACG-3′;反義鏈: 5′-CTCGCT-CCTGGAAGATGGTG-3′。采用2-ΔΔCt分析基因相對表達情況。

      1.2.2 Western 印跡法檢測Tie2表達 取正常小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠牙周組織(牙齦和牙周膜)各100mg,按照總蛋白質(zhì)提取試劑盒操作步驟收獲蛋白,蛋白定量。蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜;馬血清封閉,一抗Tie2抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶2500)分別4℃孵育過夜,洗滌后,二抗室溫孵育1h;ECL發(fā)光成像。

      1.2.3 冰凍切片熒光顯微檢測牙周組織GFP表達正常小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠處死后立即切取磨牙區(qū)牙周組織約1mm×1mm×1mm,置于切片盒,加適量OCT包埋,液氮冷凍20s后,將包埋塊置于冰凍切片機中,連續(xù)切片8μm。載玻片吸附切片后,即在熒光顯微鏡下觀察,拍照。

      1.2.4 ICP-AES檢測牙周組織納米金顆粒含量小鼠尾靜脈注射1.0g/kg劑量20、40、60、80nm粒徑GNPs。注射15min后,取牙周膜和牙齦組織共100mg,小心置入含2mL王水的螺旋蓋容積為15mL的玻璃管中,充分消解組織。126℃油浴中加熱蒸發(fā)殘余王水。殘留物在10mL的0.05mol/L HCl中重新溶解,超聲分散溶液20min,然后將樣品在ICP-AES上進行分析。

      1.3 統(tǒng)計學處理

      2 結(jié) 果

      2.1 Tie2在小鼠牙周組織中的表達差異

      實時定量PCR檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小鼠Tie2基因表達量約為正常小鼠的2.5倍(圖1A),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);Western印跡法結(jié)果也表明,與正常小鼠相比,Tie2蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠牙周組織中顯著高表達(圖1B)。

      圖1 Tie2在正常牙周與轉(zhuǎn)基因小鼠牙周 組織中的表達差異Fig.1 Expression of Tie2 in the periodontal tissues of normal and transgenic miceA為實時定量PCR,B為Western 印跡法;1為正常小鼠,2為轉(zhuǎn)基因小鼠;與正常小鼠比較,*P<0.05,n=3

      2.2 GFP在小鼠牙周組織中的表達

      正常小鼠牙周組織中未見GFP陽性表達(圖2A)。冰凍切片熒光顯微鏡下可見在轉(zhuǎn)基因小鼠牙周組織中血管均為GFP陽性,有明顯的綠色熒光成像,除了血細胞外,綠色熒光較為明顯的部位是血管壁(圖2B~D中箭頭),小血管和毛細血管在表達上沒有區(qū)別。

      2.3 納米金顆粒在小鼠牙周組織中的含量

      在正常小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠中的小鼠牙周組織中,分別對不同粒徑(20、40、60、80nm)的GNPs的組織積累量進行趨勢χ2檢驗分析,結(jié)果顯示不同粒徑的GNPs的組織積累量隨著粒徑的增大而減少(圖3),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),可以認為GNPs在小鼠牙周組織中的累積與其粒徑尺度有關(guān)。

      圖2 正常小鼠與轉(zhuǎn)基因小鼠牙周組織GFP表達情況Fig.2 Expression of GFP in periodontal tissues of normal and transgenic miceA為正常小鼠,B、C、D為轉(zhuǎn)基因小鼠;箭頭顯示GFP相對高表達的血管壁;標尺為50μm

      正常小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠的Tie2基因表達具有統(tǒng)計學差異(圖1),表現(xiàn)在不同粒徑GNPs在牙周組織中的積累量隨著粒徑的增大而減少(圖3): 同樣大小粒徑的GNPs在正常小鼠牙周組織中的累積量高于轉(zhuǎn)基因小鼠組,經(jīng)t檢驗分析顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且不同的粒徑在兩組小鼠之間均有前述表現(xiàn);20、40、60、80nm的GNPs在正常小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠中的含量差異倍數(shù)比例分別為2.6、2.625、3.75、8.0,經(jīng)趨勢χ2檢驗分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示Tie2高表達對GNPs在牙周組織中的累積阻止效率隨著顆粒粒徑的增大而增高。

      圖3 牙周組織中不同粒徑納米金顆粒的含量Fig.3 The contents of gold nanoparticles with different diameters in periodontal tissues與轉(zhuǎn)基因小鼠比較,*P<0.05,n=3

      3 討 論

      1992年,研究[5]首次報道從人胎盤中成功克隆出一種新的蛋白酪氨酸激酶受體基因TEK/Tie2。Tie2包括2個Ig樣區(qū)、3個表皮生長因子(EGF)樣區(qū)、3個纖連蛋白樣區(qū)、1個跨膜區(qū)、1個激酶區(qū)。Tie2主要表達于胎盤、肺、臍靜脈上皮細胞[6]、各種實體腫瘤組織[7]以及胚胎發(fā)育的各個階段[8]。Tie2是血管生成素家族(angipoietin, Ang)的共同受體,特異性表達于內(nèi)皮細胞和某些造血祖細胞的酪氨酸激酶型受體,在血管發(fā)育階段,其表達在轉(zhuǎn)錄水平受ELF-1因子的調(diào)節(jié)[9]。在胚胎時期血管內(nèi)皮呈均勻表達;在成年動物中,Tie2主要表達于肺血管內(nèi)皮以及卵泡、創(chuàng)口肉芽組織等進行活躍血管生成的血管內(nèi)皮[10]。Ang/Tie2信息傳遞途徑在血管生成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[11],Ang和Tie2結(jié)合,促進受體的磷酸化,表達活化Tie2的內(nèi)皮細胞吸引血管平滑肌細胞、周細胞等血管周圍細胞包圍、支持內(nèi)皮細胞形成完整的血管壁,促進血管重塑、成熟,維持血管的完整性[12]。COMP-Ang1能通過Tie2介導的PI3K/Akt活化和MAPK-AP-1信號轉(zhuǎn)導通路,增強人牙周膜成纖維細胞的活力和增殖能力,通過促進骨特異性標記物、Tie2和活化蛋白-1亞家族的表達,促進人牙周膜成纖維細胞向成骨細胞分化。可見,Tie2在牙周組織損傷修復及再生中起著重要作用[13]。牙周組織容易受細菌、結(jié)石等因素影響,誘發(fā)炎癥,使得牙周組織中血管通透性增加而形成牙齦炎性水腫。這有利于藥物和納米顆粒穿透血管在組織中累積,但是也有研究表明納米顆粒主要通過胞吞作用從而在細胞中滯留和在組織中累積。

      本實驗研究了Tie2基因表達對不同粒徑GNPs進入小鼠牙周組織并且停留情況的影響。實驗結(jié)果顯示隨著粒徑的增大,GNPs在牙周組織中的量減少。相同粒徑的GNPs在Tie2轉(zhuǎn)基因小鼠的牙周組織中的量較正常小鼠明顯少。分析原因可能與轉(zhuǎn)基因小鼠高表達Tie2,牙周膜微血管內(nèi)皮細胞的連接較正常小鼠的緊密,GNPs不容易穿過血管內(nèi)皮細胞擴散到牙周組織中。GNPs和細胞作用時,主要是通過胞吞作用(endocytosis)進入細胞的[14]。胞吞作用一般可分為吞噬作用(phagocytosis)、胞飲作用(pinocytosis)以及受體介導胞吞作用(receptor-mediated endocytosis, RME)。GNPs的內(nèi)吞屬于受體介導的胞吞作用,具有很強的專一選擇性[15]。因此,Tie2高表達的動物血管壁完整,血管通透性差,GNPs不易透過血管屏障進入組織中累積;單純的胞吞作用可以滯留GNPs。本研究顯示: GNPs在正常小鼠牙周組織中累積的量非常有限,尤其是大粒徑GNPs。在細胞水平研究,胞吞作用可能在納米顆粒作用途徑中扮演重要角色,但是在活體組織水平上,血管通透性對于納米顆粒在組織中的累積和作用可能扮演著更加重要的角色。

      本研究提示,研究納米材料在動物體內(nèi)或者人體內(nèi)的分布,除了分析材料特性因素以外,還需要考慮機體的生理病理環(huán)境的影響,通過誘導高表達保持血管完整性和穩(wěn)定血管通透性的相關(guān)基因,減少納米材料的組織分布和累積;通過相反的調(diào)控,增加納米材料在組織中的濃度。

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