聚合離子液體-多壁碳納米管化學修飾電極同時測定多巴胺、抗壞血酸與尿酸

張 玲，矯淞霖，張 慧，遲曉平，張 謙，張洪波

(1.沈陽師范大學 化學化工學院，遼寧 沈陽 110034;2.遼寧大學 化學院,遼寧 沈陽 110036)

多巴胺(DA)、抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)是人體新陳代謝中3種重要的生物小分子。人體缺乏多巴胺可導致精神分裂、帕金森病等；缺乏抗壞血酸可導致壞血?。荒蛩岽x紊亂則會引起痛風。因此，能夠?qū)?種物質(zhì)進行精確檢測，對這些疾病的診斷具有重要意義[1-2]。

目前，毛細管電泳法[3]、液相色譜法[4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、熒光法[6]和電化學法[7]已廣泛用于生物分子的檢測。其中，電化學法因具有選擇性高、靈敏度好、操作簡單和成本較低等特點而受到研究者的關注。由于AA、DA、UA均為具有電化學活性的生物小分子，因此，采用電化學方法檢測上述物質(zhì)具有一定的優(yōu)勢。但AA、DA和UA通常共存于相同的生理環(huán)境中，3者的氧化峰電位十分接近，使用常規(guī)電極進行檢測時，其電化學響應信號會互相干擾，致使檢測的靈敏度低且選擇性不高[1]。為了實現(xiàn)AA、DA和UA的同時檢測，以聚合物[8]、納米材料[9]、離子液體[1]等為修飾材料的修飾電極應運而生。

多壁碳納米管自1991年被發(fā)現(xiàn)以來，由于其獨特的幾何結(jié)構(gòu)、良好的機械強度、良好的導電能力和較強的催化性能，得到了廣泛的應用[10]。但多壁碳納米管因表面具有大π鍵，使得其在水和有機溶劑中的分散存在團聚、分散性差等問題[11]。且碳納米管在單獨使用時，易從電極表面脫落，導致電極壽命短。所以在使用時，通常要對其進行酸化或表面改性，從而達到增強碳納米管反應活性和分散性的目的。共軛改性和非共軛改性是實現(xiàn)碳納米管改性的常用手段。共軛改性會使碳納米管的結(jié)構(gòu)、性能均發(fā)生很大改變[12]；非共軛改性可在增加其他功能性的基礎上，基本保持碳納米管原有的結(jié)構(gòu)與性能[13]，其通常利用碳納米管中處于sp2雜化碳原子的離域π電子，與具有離域π電子的其他化合物(聚合物、表面活性劑或芳香化合物)之間通過π-π鍵結(jié)合來實現(xiàn)。

離子液體具有蒸汽壓低、化學和熱穩(wěn)定性好、電化學窗口寬、離子導電率高等優(yōu)勢并具有一定的離子特性[14]。2003年，F(xiàn)ukushima等[15]研究表明，單壁碳納米管與含咪唑基團的離子液體之間可形成很強的作用力，但其在應用過程中存在離子液體從電極表面脫落的問題[16]。聚合離子液體(PIL)作為一種新型材料，兼具離子液體和聚合物的特性，如離子特性、良好的成膜性、導電性、熱穩(wěn)定性等[17]。2011年本研究組合成了聚合離子液體功能化石墨烯，并以此復合物為基底，制備出穩(wěn)定的GOD/poly(ViBuIm+Br-)-G/GCE修飾電極，實現(xiàn)了對葡萄糖的檢測[18]。此外，Marcilla使用單壁碳納米管與聚合離子液體為原料，制備出SWCNT/PIL復合物，并研究了該復合物在電致變色器件中的應用[17]。2009年Wu等[19]制備出PtRu/CNTs-PIL和Pt/CNTs-PIL復合物，并利用多壁碳納米管和貴金屬納米粒子的催化特性，研究了上述復合物對甲醇的電催化氧化性能。目前尚無使用非共軛法制備聚合離子液體-多壁碳納米管進行電極修飾并用于電化學檢測AA、DA、UA的相關文獻報道。

本文利用聚合離子液體單元中的咪唑基團和多壁碳納米管間的強π-π作用，制備出聚(1-乙烯-3-乙基咪唑溴代鹽)-多壁碳納米管復合物(Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs)。通過簡單的滴涂方法即可制備得到相應的修飾電極。通過研究DA、AA、UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的電化學響應，可實現(xiàn)該電極對AA、DA和UA的同時測定，從而建立了聚合離子液體-多壁碳納米管化學修飾電極同時測定多巴胺、抗壞血酸和尿酸的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1-乙烯基咪唑、乙酸乙酯、1-溴乙烷、二甲基甲酰胺(DMF)、偶氮二異丁腈、氯仿(國藥試劑公司)；AA、DA、UA(美國Sigma公司)；以上試劑均為分析純。未酸化多壁碳納米管由清華大學化工系反應工程實驗室提供；實驗用水均為二次蒸餾水，實驗均在室溫下進行。CHI620B型電化學工作站(上海振華儀器有限公司)，實驗采用三電極體系：Pt電極作為輔助電極，飽和Ag/AgCl電極作為參比電極，化學修飾電極作為工作電極。

1.2 實驗方法

1.2.1 Poly(ViEIm+Br-)/MWCNTs復合物的制備根據(jù)文獻方法合成Poly(ViEtIm+Br-)[20]：將1-乙烯基咪唑和1-溴乙烷(摩爾比為1∶1.9)在80 ℃下，油浴回流48 h。得到的產(chǎn)物用乙酸乙酯重結(jié)晶，抽濾，真空干燥，最終得到淡黃色固體1-乙烯基-3-乙基咪唑鹽。在氯仿溶液中，通過氮氣保護，在70 ℃下，以偶氮二異丁腈(AIBN，0.04 g)為引發(fā)劑，引發(fā)1-乙烯基-3-乙基咪唑(2 g)鹽的自由基聚合反應，8 h后，將淺黃色的產(chǎn)物用氯仿洗滌數(shù)次，真空干燥得到黃色固體Poly(ViEtIm+Br-)。

取3 mg Poly(ViEtIm+Br-)和3 mg MWCNTs放入研缽中研磨30 min后，用6 mL水將反應物轉(zhuǎn)移至小燒杯中，超聲分散5 min，得到黑色、均一的懸濁液。離心(3 000 r/min，3 min)除去未分散的MWCNTs。將上清液高速離心(12 000 r/min，30 min)，除去上清液，用水洗滌，此離心/洗滌過程重復3次以除去未復合的Poly(ViEtIm+Br-)。真空干燥后，即得到Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs復合物。

1.2.2 Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE的制備將4 mg Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs與2 mL水混合，超聲30 min后，配制成2 mg/mL Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs分散液。取10 μL上述分散液分2次(每次5 μL)均勻涂覆于拋光后的玻碳電極(Φ=3 mm)表面，隔夜干燥后即得到Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE。

1.2.3 MWCNTs/GCE的制備將1 mg MWCNTs與1 mL二甲基甲酰胺(DMF)混合，制備出MWCNTs-DMF混合液。取10 μL該混合液滴涂于拋光后的玻碳電極(Φ=3 mm)表面，待其干燥即制得MWCNTs/GCE。

2 結(jié)果與討論

2.1 Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs復合物的表征

采用FT-IR技術對不同材料的性質(zhì)進行表征，圖1為MWCNTs(a)、Poly(ViEtIm+Br-)(b)與Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs(c)的紅外光譜對比圖。從曲線a中可觀察到MWCNTs的紅外吸收曲線并無明顯的吸收峰[21]。曲線b可觀察到在2 800～3 300 cm-1和1 556 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，其對應于Poly(ViEtIm+)結(jié)構(gòu)[20]，在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs復合物的紅外譜圖(曲線c)中同樣可觀察到上述吸收峰。實驗結(jié)果表明，Poly(ViEtIm+Br-)與MWCNTs已成功復合，實現(xiàn)了MWCNTs的功能化。

圖2為Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs的TEM圖。如圖所示，碳納米管并未糾纏在一起或斷裂成碎片，該檢測進一步驗證了聚合離子液體與碳納米管之間的π-π相互作用可有效保持碳納米管初始結(jié)構(gòu)，且聚合離子液體的存在為碳納米管引入了大量正電荷，使得碳納米管之間的靜電力相互排斥，具有分散性，可以與水形成穩(wěn)定的分散體系。

2.2 Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE的穩(wěn)定性研究

在PBS溶液中，對Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE進行循環(huán)伏安掃描，連續(xù)掃描50圈后，循環(huán)伏安曲線中的電流值并未發(fā)生顯著變化，說明Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE的穩(wěn)定性良好。

2.3 不同化學修飾電極對AA、DA和UA的電催化性能研究

分別考察了DA、AA和UA在GCE和Poly(ViEtIm+Br-)/GCE、MWCNTs/GCE和Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的循環(huán)伏安曲線。結(jié)果顯示，在GCE上，AA、DA和UA的氧化峰分別位于308、234、324 mV。AA-DA、DA-UA間氧化峰電位差分別為74 mV和90 mV(圖3A)。3者峰位相近，峰位差很小，因此同時測定時3種組分會形成相互干擾，無法實現(xiàn)AA、DA和UA的同時測定。在Poly(ViEtIm+Br-)/GCE上也存在AA、DA、UA峰位差互相接近的相似結(jié)果(圖3B)。然而，電極在經(jīng)過MWCNTs修飾后(MWCNTs/GCE、Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE)，可發(fā)現(xiàn)AA和DA在MWCNTs/GCE(圖3C)、Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(圖3D)上的氧化峰峰位均發(fā)生了明顯負移。且UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的氧化電位(348 mV)相對于MWCNTs/GCE(361 mV)表現(xiàn)出進一步負移。通過以上研究，可以發(fā)現(xiàn)MWCNTs對電極的修飾可有效降低AA、DA、UA在電極表面的氧化電位，體現(xiàn)了MWCNTs具有良好催化作用的特性[22]；同時，在pH 7.4的PBS溶液中，由于UA(pI=5.75)帶有負電荷，MWCNTs在聚合離子液體功能化后具有良好的協(xié)同效應，即在碳納米管保持導電性的基礎上引入了大量正電荷，使得該復合物與AA、UA具有靜電吸引作用，這種協(xié)同效應使AA和UA可以在電極表面充分接觸，進而增強電極的電子傳輸性能。

圖3 1 000 μmol/L DA、1 000 μmol/L AA和1 000 μmol/L UA溶液分別在GCE(A)和Poly(ViEtIm+Br-)/GCE(B)、MWCNTs/GCE(C)和Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(D)上的循環(huán)伏安曲線Fig.3 CV curves of 1 000 μmol/L DA,1 000 μmol/L AA and 1 000 μmol/L UA solution at GCE(A),Poly(ViEtIm+Br-)/GCE(B),MWCNTs/GCE(C) and Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(D),respectively 0.1 mol/L PBS，pH 7.4,scan rate:100 mV/s

圖4 1 000 μmol/L AA、 DA和 UA混合溶液在GCE(a)、MWCNTs/GCE(b)和Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(c)上的循環(huán)伏安曲線Fig.4 CV curves of mixed solution containing 1 000 μmol/L AA,DA and UA at GCE(a),MWCNTs/GCE(b)and Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(c) scan rate:100 mV/s,pH 7.4 PBS buffer

在此基礎上，進一步比較了AA、DA、UA在不同電極表面的循環(huán)伏安響應電流。對比圖3A和圖3B，可以發(fā)現(xiàn)DA、UA在Poly(ViEtIm+Br-)/GCE上的氧化峰電流較GCE均表現(xiàn)出降低的趨勢，這說明聚合離子液體對DA、UA的電子轉(zhuǎn)移具有“阻塞效應”[23]。而AA、DA、UA在MWCNTs/GCE(圖3C)表面的氧化電流較GCE和Poly(ViEtIm+Br-)/GCE均有明顯增強，此現(xiàn)象進一步說明MWCNTs對AA、DA、UA的催化作用。當Poly(ViEtIm+Br-)與MWNTs復合后，盡管Poly(ViEtIm+Br-)對DA、UA的電子轉(zhuǎn)移具有阻塞效應，AA、DA和UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(圖3D)上的氧化峰電流仍顯著增加，電流的大小為MWCNTs/GCE的1.5～3.0倍。上述結(jié)果表明Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs復合物對AA、DA和UA的氧化具有協(xié)同效應，能夠有效改善電極對AA、DA、UA的氧化催化性能并促進三者的在電極表面的電子轉(zhuǎn)移[24]。

圖4對比了GCE、MWCNTs/GCE和Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE對1 000 μmol/L AA、 DA和 UA混合液的測定。曲線a表示AA、DA和UA混合樣品在GCE上的循環(huán)伏安響應，其陽極顯示出兩個很寬的氧化峰，且電流響應微弱，根據(jù)峰位判斷，AA和DA的氧化峰重疊，因此無法實現(xiàn)對3種物質(zhì)的同時測定。曲線b表示混合液在MWCNTs/GCE上的循環(huán)伏安響應，在該循環(huán)伏安曲線陽極枝上，于45 mV、197 mV和338 mV處觀察到3個獨立的氧化峰，分別對應AA、DA和UA的電化學氧化。其中，DA-AA峰電位差為152 mV，DA-UA峰電位差為141 mV。由于AA、DA、UA在MWCNTs/GCE上分峰明顯且峰差較大，因此MWCNTs/GCE有利于實現(xiàn)對AA、DA和UA 3者的同時測定。混合液在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的循環(huán)伏安響應曲線顯示，AA、DA和UA在該曲線的陽極枝上同樣出現(xiàn)3個明顯的氧化峰(曲線c)，相對于MWCNTs/GCE，AA、DA、UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE表面的氧化電流明顯增加，其對應的峰電位分別為-26 、189、346 mV，其中，AA-DA峰電位差為215 mV，DA-UA峰電位差為157 mV，表明其在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的峰電位差更大。其原因可能是因為Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs復合物中由于聚合離子液體的存在，使得電極表面具有大量的正電荷，有利于AA、DA、UA在電極表面的選擇性催化[19,25-26]；與此同時，由于聚合離子液體與碳納米管之間的作用力為π-π吸附，納米管的物理化學性質(zhì)(如導電性、催化特性等性質(zhì))未被破壞，有利于促進AA、DA、UA在電極表面的催化氧化[27]。因此，Poly(ViEtIm+Br-)與MWCNTs的協(xié)同效應使Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE對AA、DA、UA具有更好的選擇性響應和電催化增強性能[28]。

2.4 溶液pH值對AA、DA、UA氧化峰電流及其峰位差的影響

采用循環(huán)伏安法考察了不同pH值(5.7、6.0、6.5、7.0、7.4、8.0)溶液對AA、DA和UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上氧化峰電流及峰電位差的影響，結(jié)果如圖5所示。其中，圖5A為pH值對AA、DA和UA 3者氧化峰電流的影響?？梢钥吹?，AA、DA和UA均在pH 7.4時呈現(xiàn)最大的氧化峰電流。pH值對AA、DA和UA間氧化峰位差的影響研究顯示，AA-DA的氧化峰位差在pH為5.7時具有最大值，隨著pH值升高，峰電位差緩慢縮小，在pH 7.0時達到最小，pH 7.4時，峰位差再次呈現(xiàn)增大趨勢，而后減小。AA-UA的氧化峰位差從pH 8.0到5.0區(qū)間內(nèi)，隨著pH值的減小，峰位差整體呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。DA-UA的氧化峰位差隨著pH值的變化，整體起伏并不明顯，且在pH 7.0時具有最大的峰電位差。綜合考慮pH值對峰電位差和峰電流的影響，pH值為7.4時，AA-DA和DA-UA的氧化峰電位差較大，對應的AA、DA、UA響應電流較高，且該pH值與人體生理pH環(huán)境相當，因此本實驗選擇pH 7.4為最佳檢測條件。

圖5 50 μmol/L DA、400 μmol/L AA和50 μmol/L UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的氧化峰電流(A)及氧化峰電位差(B)與pH值的關系Fig.5 Effects of pH values on peak current(A)and peak potential(B) of 50 μmol/L DA,400 μmol/L AA and 50 μmol/L UA on Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE

2.5 Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE選擇性檢測AA、DA和UA的研究

為考察Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE選擇性檢測AA、DA和UA的可行性，本實驗采用DPV技術，在3種組分共存時，改變其中1種組分濃度，固定其他2種組分濃度的條件下，分別考察了AA(圖6)、DA(未列出)和UA(未列出)在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上隨著濃度不同，氧化峰電流的變化情況。

圖6 含有不同濃度AA的混合液(DA和UA濃度分別為40 μmol/L和 60 μmol/L)在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的DPV圖Fig.6 DPV curves of different concentrations of AA in mixture containing 40 μmol/L DA and 60 μmol/L UA at Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE AA concentrations:50,100,400,600,800,1 000,1 200,1 400,1 600,1 800,2 000,2 200,2 400,2600,2 800,3 000,3 200,3 400,3 600,3 800,4 000,4 200,4 600,4 800,5 000 μmol/L;scan rate:50 mV/s,0.1 mol/L PBS,pH 7.4；insert:calibration curve between AA concentration and current

如圖6所示，固定DA和UA濃度分別為40、60 μmol/L，改變AA的濃度，可觀察到AA的峰電流隨著其濃度的增大而增長。以AA濃度為橫坐標，其氧化峰電流為縱坐標作圖，可以看到，在50～2 400 μmol/L范圍內(nèi)(IAA=0.026 80cAA-0.056 21，r2=0.992 5)和在2 600～5 000 μmol/L范圍內(nèi)(IAA=0.014 53cAA+28.42，r2=0.994 3)，AA的濃度與電流響應具有線性關系(圖6插圖)。同樣，固定AA和UA濃度分別為400、60 μmol/L，改變DA濃度，考察DA峰電流的變化規(guī)律，結(jié)果顯示，DA濃度在2～180 μmol/L范圍內(nèi)與其電流存在線性關系，其線性方程為IDA=0.389 5cDA-3.330(r2=0.996 8)。固定AA和DA濃度分別為400、40 μmol/L，改變UA濃度，結(jié)果顯示，UA的峰電流同樣隨其濃度的增大而表現(xiàn)為線性增長，在4～50 μmol/L范圍內(nèi)，其線性方程為IUA=1.298cUA+9.831(r2=0.994 1)。經(jīng)計算，得到AA、DA和UA檢出限(S/N=3)分別為22.2、0.4、0.9 μmol/L。

通過文獻對比，發(fā)現(xiàn)本實驗中Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE對AA、DA、UA的檢測性能優(yōu)于空心氮摻雜碳納米微球修飾電極(HNCMS/GC)[29]；與通過聚合離子液體單體自由基聚合而制備的聚合離子液體-碳納米管修飾電極相比(PIL-MWCNT/GCE)[24]，Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE對AA的檢測具有更寬的線性范圍，對DA具有更低的檢出限。

2.6 實際樣品的測定與回收率

在優(yōu)化條件下，使用Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE對維生素C注射劑中的AA和鹽酸多巴胺注射劑中的DA含量進行分析。測定過程中，需將維生素C注射劑或鹽酸多巴胺注射針劑用0.1 mol/L pH 7.4的PBS稀釋至合適濃度，然后采用DPV法對溶液進行檢測。為了驗證該方法的有效性,采用標準加入法在樣品中加入一定濃度的AA、DA標準溶液，然后分別測定AA、DA的含量，測定結(jié)果如表1所示。

由表1可知，在維生素C注射劑樣品中，測得AA的回收率為98.9%～101%；在鹽酸多巴胺注射劑樣品中，測得DA的回收率為98.8%～101%，二者相對標準偏差(RSD)均小于3%。以上結(jié)果表明該方法具有較好的回收率，該電極在實際樣品檢測中的精確度和準確性較高。

表1 維生素C注射劑及鹽酸多巴胺注射劑中AA、DA的測定Table 1 Determination of AA and DA in Vitamin C injection and dopamine hydrochloride injection

2.7 Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

以Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE為工作電極，在含有AA(600 μmol/L)、DA(50 μmol/L)及UA(30 μmol/L)的pH 7.4 PBS中進行循環(huán)伏安掃描，使用同一工作電極重復實驗6次，計算其RSD分別為2.4%、1.2%和2.6%。電極干燥5d后，在相同條件下，AA、DA和UA的電流響應分別下降3.0%、2.5%和3.4%。由此可見，該電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好。

3 結(jié) 論

本文將聚合離子液體與多壁碳納米管相結(jié)合，使用非共軛法成功制備出聚合離子液體-多壁碳納米管復合物(Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs)。通過紅外光譜及TEM技術進一步對該復合物的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進行表征。利用該復合物分散性良好，且聚合物成膜性良好的特點，通過簡單滴涂的方式即可形成均勻穩(wěn)定的電極修飾薄膜(Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE)。在此基礎上，研究了AA、DA、UA在該電極表面的電化學行為，結(jié)果顯示該電極對AA、DA、UA具有優(yōu)異的電化學催化活性，3者分峰明顯，可實現(xiàn)3種物質(zhì)的同時測定。將Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE用于維生素C注射劑中AA和鹽酸多巴胺注射劑中DA的測定,檢測效果良好。本方法進一步擴展了離子液體修飾化碳基材料在實際電化學分析中的應用。