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      分散固相萃取凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂王漿中雙甲脒、單甲脒及其代謝物

      2019-05-14 07:58:56侯建波史穎珠姚濱濱
      分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2019年4期
      關(guān)鍵詞:蜂王漿代謝物乙腈

      侯建波,謝 文,錢 艷,史穎珠,姚濱濱,汪 鵬,盛 濤

      (1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院,浙江 杭州 310016;2.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,浙江 杭州 310016;3.浙江立德產(chǎn)品技術(shù)有限公司,浙江 杭州 310016)

      蜂王漿是蜂巢中培育幼蟲的青年工蜂咽頭腺的分泌物,也是蜜蜂生長(zhǎng)和繁衍過(guò)程中的食物。研究發(fā)現(xiàn),蜂王漿極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和免疫功能,其富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物元素,具有輔助控制血管擴(kuò)張,降低血糖、血脂、血壓,護(hù)肝,提高免疫力以及抗衰老等功效[1-2]。隨著蜂王漿的消費(fèi)需求不斷增長(zhǎng),對(duì)其質(zhì)量的要求也越來(lái)越高,其中藥物殘留是衡量蜂王漿產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)。

      雙甲脒(Amitraz),又稱N,N-雙(2,4-二甲苯亞氨基甲基)甲胺,屬于一種常見的有機(jī)氮?dú)⑾x、殺螨劑,廣泛用于蔬菜、茶葉、棉花等作物以防治害螨、蚜蟲、棉鈴蟲等[3]。由于其可以有效防治狄瓦氏螨引起的蜂病且對(duì)蜜蜂低毒,因此廣泛用于蜂巢除螨[4-5]。單甲脒(Semiamitraz),又稱N′-(2,4-二甲基苯基)-N-甲基亞胺甲酰胺(DMPF),其既是雙甲脒的代謝產(chǎn)物,也是殺螨劑,且對(duì)蜜蜂比較安全,可作為農(nóng)藥單獨(dú)使用[6]。雙甲脒和單甲脒可代謝分解形成2,4-二甲基苯基甲酰胺(DMF)和2,4-二甲基苯胺(DMA)。其中DMA是合成單甲脒和雙甲脒的化工原料,其具有毒副作用和致突變性,對(duì)肝臟的損傷較大[7]。因此各國(guó)紛紛制定雙甲脒在農(nóng)產(chǎn)品及蜂產(chǎn)品中的最低限量,歐盟、日本和美國(guó)規(guī)定蜂產(chǎn)品中雙甲脒的最低限量為0.2 mg/kg,并要求同時(shí)檢測(cè)其代謝物[8-11]。

      目前,蜂產(chǎn)品中雙甲脒的測(cè)定通常是在酸、堿環(huán)境下高溫水解生成最終代謝產(chǎn)物DMA,通過(guò)氣相色譜法(GC)[12-17]和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[18-22]進(jìn)行檢測(cè),再轉(zhuǎn)化成雙甲脒的含量。隨著色譜分離手段的提高和質(zhì)譜檢測(cè)器的使用,研究人員采用氣相色譜法[23-24]、氣相色譜-質(zhì)譜法[25]、高效液相色譜法(HPLC)[26-29]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[30-34]對(duì)蜂產(chǎn)品中的雙甲脒及其代謝物進(jìn)行直接測(cè)定。然而同時(shí)測(cè)定雙甲脒、DMPF及其代謝物DMF和DMA的相關(guān)研究較少[35-37]。本研究采用緩沖溶液、乙腈、氯化鈉沉淀蜂王漿中的蛋白質(zhì)和提取目標(biāo)化合物,以N-丙基乙二胺(PSA)、C18和無(wú)水硫酸鎂進(jìn)行分散固相萃取凈化(dSPE),建立了同時(shí)檢測(cè)蜂王漿中雙甲脒、DMPF、DMF和DMA殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

      1 實(shí)驗(yàn)部分

      1.1 儀器與試劑

      1260-6495型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司,配有電噴霧離子源),臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司);IKA MS3 Basic型渦旋器(德國(guó)IKA公司)。

      雙甲脒、DMPF、DMF和DMA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%,Dr.Ehrenstorfer公司),雙甲脒-D6標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,TRC公司),DMA-D6標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,C/D/N Isotopes公司)。用乙腈將各標(biāo)準(zhǔn)品溶解并定容得10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,根據(jù)需要用乙腈將其稀釋至所需濃度。

      氯化鈉(純度≥99.5%)、PSA、C18和石墨化碳黑(GCB)粉末(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);無(wú)水硫酸鎂(MgSO4)粉末(純度≥98.0%,西隴科學(xué)股份有限公司);乙腈、甲醇和甲酸(色譜純,德國(guó)Merck公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水(由Milli-Q超純水器制備);pH 4.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11的緩沖溶液(愛爾蘭Reagecon公司)。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 樣品提取稱取2 g蜂王漿樣品(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中,加入100 μL 400 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)溶液和pH 9.0的緩沖溶液至10 mL,2 000 r/min渦旋混合1 min,靜置5 min,加入10 mL乙腈和2 g 氯化鈉,2 000 r/min渦旋混勻1 min,靜置5 min,8 500 r/min離心5 min,移取上層乙腈相至另一50 mL具塞離心管,水相再加入10 mL乙腈,2 000 r/min渦旋混勻,靜置5 min,8 500 r/min離心5 min,合并乙腈提取液,定容至20 mL,混勻待凈化。

      1.2.2 樣品凈化將1.0 mL提取液轉(zhuǎn)移至含有25 mg PSA、10 mg C18和30 mg 無(wú)水MgSO4的15 mL具塞離心管中,2 000 r/min渦旋混勻30 s,8 500 r/min離心5 min,轉(zhuǎn)移全部上清液,加水定容至2.0 mL,渦旋混勻,過(guò)0.22 μm濾膜后,待測(cè)定。

      1.2.3 色譜條件色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:A為0.15%甲酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0~8.0 min,40%~65%B;8.0~9.0 min,65%~95%B;9.0~14.0 min,95%B;14.0~15.0 min,95%~40%B;15.0~16.0 min,40%B,16.0~19.0 min,保持40%B進(jìn)行系統(tǒng)平衡。流速變化程序:0~8.0 min,保持0.4 mL/min;8.0~9.0 min,0.4~0.7 mL/min;9.0~15.0 min,保持0.7 mL/min;15.0~16.0 min,0.7~0.4 mL/min;16.0~19.0 min,保持0.4 mL/min進(jìn)行系統(tǒng)平衡。進(jìn)樣量為10 μL;柱溫為25 ℃。

      1.2.4 質(zhì)譜條件離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:正離子掃描;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);毛細(xì)管電壓:2 500 V;離子源溫度:130 ℃;干燥氣流量:16 L/min;鞘氣溫度:250 ℃,鞘氣流量:11 L/min。其它質(zhì)譜條件見表1。

      表1 雙甲脒、DMPF及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of amitraz,DMPF and their metabolites

      * quantitative ion pair

      2 結(jié)果與討論

      2.1 提取條件的選擇

      已有研究表明,酸性環(huán)境下雙甲脒易發(fā)生分解[34,38]??疾炝朔渫鯘{基質(zhì)中加入不同pH值緩沖溶液(pH 4.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11)對(duì)目標(biāo)物提取效果的影響。結(jié)果表明,蜂王漿提取溶液在pH 7.0~8.0下的提取效果最佳。其中雙甲脒和DMPF易受到pH值的影響,在酸性環(huán)境下,雙甲脒的回收率明顯降低;當(dāng)pH>8.0時(shí)DMPF的回收率開始下降,當(dāng)pH>10時(shí),其回收率小于60%。由于蜂王漿溶液偏弱酸性,實(shí)驗(yàn)最終選擇加入pH 9.0的緩沖溶液,此時(shí)蜂王漿提取溶液pH為7.0~8.0,可達(dá)到最佳提取效果。

      圖1 不同用量PSA、C18和無(wú)水MgSO4對(duì)凈化結(jié)果的影響(n=3)Fig.1 Effect of different dosage of PSA,C18 and MgSO4 on purification result(n=3)

      分別采用乙腈和甲醇對(duì)蜂王漿基質(zhì)進(jìn)行沉淀蛋白、目標(biāo)物提取和凈化試驗(yàn)。結(jié)果表明:甲醇沉淀蛋白質(zhì)的效果略好于乙腈,但乙腈的凈化回收率比甲醇高10%左右,且回收率更穩(wěn)定。結(jié)合流動(dòng)相體系,最終選用乙腈作為蛋白沉淀劑和目標(biāo)物提取劑,同時(shí)加入氯化鈉有助于乙腈和水相分層,提高提取效率。

      2.2 凈化條件的選擇

      分別考察了PSA、C18、GCB和無(wú)水MgSO4對(duì)目標(biāo)化合物的吸附情況,結(jié)果顯示單獨(dú)使用15、30、100 mg的GCB時(shí)對(duì)雙甲脒的吸附均達(dá)到90%以上,導(dǎo)致雙甲脒的回收率小于10%。而單獨(dú)使用PSA、C18或無(wú)水MgSO4時(shí)4種目標(biāo)化合物的回收率均大于75%。因此進(jìn)一步考察了PSA、C18和無(wú)水MgSO4不同用量組合時(shí)的凈化效果,結(jié)果表明隨著吸附劑用量的增加,各目標(biāo)物的回收率均降低,其中DMPF的回收率降低最明顯(圖1)。實(shí)驗(yàn)最終采用25 mg PSA+10 mg C18+30 mg無(wú)水MgSO4對(duì)蜂王漿提取液進(jìn)行凈化,此時(shí)4種目標(biāo)化合物的回收率最大。

      2.3 液相色譜條件的選擇

      參考文獻(xiàn)方法[35],本實(shí)驗(yàn)選擇C18色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離,以乙腈-0.15%甲酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,并在9.0 min時(shí)將流速提升至0.7 mL/min,從而縮短雙甲脒的保留時(shí)間??紤]到雙甲脒的酸不穩(wěn)定性,并結(jié)合前處理凈化條件,最終采用乙腈-水(體積比1∶1)定容,對(duì)目標(biāo)化合物的色譜峰形基本無(wú)影響。優(yōu)化的色譜條件如“1.2.3”所示。

      2.4 質(zhì)譜條件的選擇

      在正離子模式下,采用直接進(jìn)樣方式對(duì)1.0 μg/mL待測(cè)化合物的單標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描,確定分子離子峰,再以分子離子為母離子,對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描。按照歐盟EC/657指令,串聯(lián)質(zhì)譜法定量確證須滿足4個(gè)識(shí)別點(diǎn)的要求(母離子1點(diǎn),特征子離子1.5點(diǎn)/個(gè)),本實(shí)驗(yàn)選擇2個(gè)特征子離子進(jìn)行測(cè)定,其中以信噪比高、峰形好、干擾小的離子對(duì)作為定量離子對(duì),另一個(gè)離子對(duì)作為定性離子對(duì)。以MRM正離子模式優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù),發(fā)現(xiàn)雙甲脒和單甲脒易發(fā)生源內(nèi)裂解,將離子源毛細(xì)管電壓設(shè)為2 500 V,離子源溫度和鞘氣溫度分別設(shè)為130 ℃和250 ℃,可以有效保證離子化效率并降低源內(nèi)裂解。最佳質(zhì)譜條件見表1。

      圖2 空白蜂王漿基質(zhì)溶液加標(biāo)(5 μg/kg)的提取離子流圖Fig.2 The extracted ion chromatograms of spiked solution on royal jelly matrix(5 μg/kg)

      2.5 基質(zhì)效應(yīng)

      采用本方法分別測(cè)定混合溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白基質(zhì)加標(biāo)溶液,通過(guò)計(jì)算離子抑制率來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)情況[39-40]。其中,離子抑制率(%)=(混合溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中響應(yīng)強(qiáng)度-空白基質(zhì)加標(biāo)溶液中響應(yīng)強(qiáng)度)×100%/混合溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果顯示,雙甲脒和DMA的離子抑制率相對(duì)較大,分別為32.0%和24.4%,存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)最終采用空白基質(zhì)加標(biāo)溶液配制線性工作曲線,同時(shí)結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法定量以降低基質(zhì)效應(yīng)。

      2.6 方法線性關(guān)系與定量下限

      采用本方法測(cè)定質(zhì)量濃度為0、5、10、20、50、100 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以目標(biāo)物與同位素內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo),以待測(cè)物的質(zhì)量濃度(X,μg/kg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知,各化合物在0~100 μg/kg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)大于0.996。以10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算方法定量下限,雙甲脒、DMPF、DMF和DMA的定量下限分別為0.10、0.25、5.0、2.5 μg/kg。空白蜂王漿樣品加標(biāo)5 μg/kg的提取離子流圖見圖2。

      2.7 方法回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

      在空白蜂王漿中進(jìn)行5、10、20 μg/kg 3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)濃度做6個(gè)平行樣品。結(jié)果顯示,4種目標(biāo)物的回收率為77.0%~107%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%~11%。

      表2 雙甲脒、DMPF及其代謝物的線性關(guān)系、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Linear relationships,recoveries and relative standard deviations of amitraz,DMPF and their metabolites(n=6)

      2.8 實(shí)際樣品分析

      應(yīng)用本方法對(duì)市場(chǎng)采購(gòu)的15批次不同品牌蜂王漿樣品進(jìn)行測(cè)定,其中1個(gè)樣品檢出雙甲脒,含量為37.2 μg/kg,該結(jié)果與GB 23200.103-2016[17]的檢測(cè)結(jié)果一致。

      3 結(jié) 論

      本文建立了分散固相萃取凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(dSPE/LC-MS/MS)測(cè)定蜂王漿中雙甲脒、單甲脒及其代謝物殘留量的方法。采用pH 9.0的緩沖溶液稀釋蜂王漿樣品,通過(guò)乙腈和氯化鈉進(jìn)行蛋白沉淀、鹽析提取,N-丙基乙二胺、C18和無(wú)水硫酸鎂進(jìn)行分散固相萃取凈化,LC-MS/MS法進(jìn)行分離測(cè)定,同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。該方法前處理過(guò)程環(huán)境友好,簡(jiǎn)便快捷,檢測(cè)成本低,定量下限滿足目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)化合物最大殘留限量的要求,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂王漿中雙甲脒、DMPF及其代謝物殘留情況的有效監(jiān)控。

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