楊 寧,周 敏,王 榮,劉 芬,王蘇霞,馬永鈞

(西北師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 甘肅省生物電化學(xué)與環(huán)境分析重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

瓜氨酸是一種最先從西瓜汁中發(fā)現(xiàn)的非蛋白類氨基酸,在一些葫蘆科植物生物組織中的含量較為豐富。西瓜、甜瓜、籽瓜和哈密瓜都是我國重要的經(jīng)濟類作物，尤其紅瓤西瓜組織內(nèi)含有多種維生素、微量元素、番茄素和瓜氨酸[1-2],人們通過鮮食瓜瓤組織即可直接攝取這些營養(yǎng)物質(zhì)從而獲得保健作用[3-4]。從人體生理學(xué)角度看，瓜氨酸是人體中參與尿素代謝的一個重要中間物,適度攝入瓜氨酸可以增強人體的免疫力，促進血液循環(huán)，保護心血管；瓜氨酸還可以作為一種有效化學(xué)成分用于生產(chǎn)保健食品和護膚、去斑美容化妝品[5-6]。此外，瓜氨酸在一些疾病的防治方面也扮演著重要角色，可用于阿爾茲海默綜合癥和由暫發(fā)性腦血管缺血導(dǎo)致的失憶癥的輔助治療，對罹患高血壓絕經(jīng)婦女的主動脈硬化和肌肉機能改善也有良好的功效[7-8]。

瓜氨酸又稱為氨基甲酰鳥氨酸[5]，其分子結(jié)構(gòu)式見圖1。目前，瓜氨酸的分析方法主要有高效液相色譜法[9-10]、生物酶法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]、熒光猝滅法[13]、間接核磁共振法[14]等。這些方法中，將瓜氨酸化學(xué)衍生化后再進行分析的方式非常普遍[9-10,12-13]，樣品預(yù)處理環(huán)節(jié)也相對較復(fù)雜，儀器成本高。因而簡化衍生反應(yīng)，盡量減少樣品預(yù)處理過程中的繁瑣操作，并降低整個分析過程的時間成本和儀器使用成本都是開發(fā)新方法必須考慮的因素。近年來，毛細管電泳法因具有分離效率高、分析速度快、進樣量小以及分析成本低等優(yōu)勢，在復(fù)雜生物樣品中氨基酸類化合物的定量分析方面得到了廣泛應(yīng)用[15-17]。

圖1 瓜氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of citrulline molecule

另一方面，電致化學(xué)發(fā)光法(ECL)具有高靈敏度、高選擇性和高信噪比響應(yīng)等優(yōu)勢，毛細管電泳-電致化學(xué)發(fā)光聯(lián)用分析法(CE-ECL)也得到了長足的發(fā)展[18-19]。眾所周知，二氯三聯(lián)吡啶合釕(Ru(bpy)3Cl2)及其衍生物是一類重要的電致化學(xué)發(fā)光探針試劑[20-22]，可與胺類共發(fā)光物產(chǎn)生特殊的共發(fā)光效應(yīng)，且胺類化合物的ECL強度按叔胺﹥仲胺﹥伯胺有依次下降的趨勢[23-24]?；谠撛恚疚膮⒄沾饲暗奈墨I[25-26]對柱前衍生氨基酸的方法做了改進，以甲醛和硼氫化鈉為主要衍生試劑，將瓜氨酸分子中與α-碳原子相連的伯氨基進行徹底N-甲基化形成叔胺基團，從而極大地增加了電致化學(xué)發(fā)光法檢測瓜氨酸的靈敏度，據(jù)此建立了一種柱前衍生CE-ECL法測定瓜瓤組織中瓜氨酸含量的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型多參數(shù)分析測試系統(tǒng)(西安瑞邁電子科技有限公司)；CHI 760B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；熔融石英毛細管(47.5 cm×75.0 μm i.d.河北永年光導(dǎo)纖維廠)；pH-10型酸度計(德國賽多利斯)；化學(xué)發(fā)光檢測采用三電極系統(tǒng)：工作電極采用參照文獻制備[27]的含稀土類普魯士藍(Er-PBAs)修飾的鉑盤電極(Φ=0.3 mm)，輔助電極為鉑絲，參比電極為Ag/AgCl(1.0 mol/L KCl)電極。

L-瓜氨酸(含量>99.0%)、二氯三聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)3Cl2·6H2O,含量>99.95%)和殼聚糖(脫乙酰度>95%)均購自百靈威科技有限公司；甲基-β-環(huán)糊精、環(huán)己烯二酸(含量>98%)(上海阿拉丁試劑有限公司)；順丁烯二酸(含量>98%，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)。其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水(>18 MΩ·cm)。

1.2 電泳測定條件

分析毛細管采用殼聚糖做內(nèi)壁修飾處理劑[28]。將0.25 mol/L的氫氧化鈉打入新毛細管內(nèi)處理0.5 h后，以清水沖洗；再將含有12.0 mmol/L 十二烷基硫酸鈉+10.0 mmol/L的硼酸+10.0 mmol/L的醋酸鈉+4.0 mmol/L環(huán)己烯二酸+1.1 mmol/L戊二醛的混合溶液打入毛細管內(nèi)，放置50 min后用氬氣排空；再打入含10.0 mg/mL殼聚糖的稀冰醋酸溶液(1%,體積分數(shù))靜置1 h，用氬氣排空后立即在65 ℃烘箱中加熱90 min；最后用1.0 mol/L甲醛溶液和0.01 mol/L氫氧化鈉溶液依次打入毛細管內(nèi)并各停留數(shù)十秒后排空，再置于烘箱中以65 ℃熱處理10 min，取出冷卻至室溫，備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液與試樣溶液的制備與衍生步驟

配制含250 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 5.95)以及含有10%甲醇的2.00 mmol/LL-瓜氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液并置于4 ℃冰箱中保存，備用。

分別稱取1.000 0 g 去籽并搗碎的西瓜、甜瓜、籽瓜、哈密瓜的鮮瓜瓤樣品于100 mL小燒杯中，各加入20.00 mL含有10%甲醇的蒸餾水，置于超聲波器中振蕩提取10 min，攪勻后靜置片刻，取上層清液備用。

在10 mL比色管中先加入1.00 mL 250 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 5.95),用移液管準(zhǔn)確加入一定體積的瓜瓤組織浸取液或L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(要求樣品的總體積< 2.0 mL)，再加入0.80 mL 0.5 mol/L的甲醛溶液并用超純水稀釋至5.0 mL后于常溫下反應(yīng)60 min；此后，在該比色管中連續(xù)加入0.40 mL 0.2 mol/L的氫氧化鈉、0.60 mL 0.01 mol/L的順丁烯二酸和0.16 mL 0.1 mol/L的咪唑溶液，搖勻后置于 57 ℃恒溫水浴中加熱反應(yīng)50 min；最后，向該比色管中依次加入0.25 mL 0.1 mol/L醋酸銨、1.00 mL 0.25 mol/L硼氫化鈉(使用時臨時配制)以及0.50 mL 0.2 mol/L的硼酸。這3種試劑的加入反應(yīng)時間間隔依次保持為10、20、10 min。最后稀釋至10.0 mL，取此溶液適量，經(jīng)濾膜過濾后進樣測定，也可于冰箱中保存，在2周內(nèi)進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-瓜氨酸衍生產(chǎn)物的電致化學(xué)發(fā)光響應(yīng)特征

對比L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物及其衍生產(chǎn)物的CE-ECL電泳圖，結(jié)果顯示，未經(jīng)衍生的L-瓜氨酸進樣后幾乎看不到任何明顯的發(fā)光信號峰，而經(jīng)衍生后，L-瓜氨酸樣品出現(xiàn)了兩個明顯的電泳信號峰(圖2)。通過加標(biāo)驗證實驗，確定1號峰源于反應(yīng)剩余甲醛的發(fā)光衍生物，而2號峰源于L-瓜氨酸衍生產(chǎn)物中唯一具有發(fā)光活性的組分。對比曲線a和b在峰2處的強度可知，L-瓜氨酸衍生物相比未衍生L-瓜氨酸的發(fā)光強度至少增敏了200多倍，且無其它雜質(zhì)峰出現(xiàn)。由圖1結(jié)構(gòu)式可知，瓜氨酸是具有α-伯胺基的氨基酸，衍生反應(yīng)將瓜氨酸分子中與α-C相連的氨基徹底N-甲基化形成含α-叔胺基的分子結(jié)構(gòu)，得到ECL發(fā)光信號更強的衍生物結(jié)構(gòu)，且瓜氨酸在柱前衍生反應(yīng)中會發(fā)生消旋化現(xiàn)象[29],因此含叔胺基的衍生產(chǎn)物的ECL發(fā)光信號強度值將不會受到被測樣品中瓜氨酸分子旋光性的影響。由此可知，通過控制柱前衍生反應(yīng)條件可使L-瓜氨酸或D-瓜氨酸都轉(zhuǎn)化成發(fā)光產(chǎn)物，得到峰形對稱的單一的CE-ECL電泳峰，進而可實現(xiàn)對瓜氨酸總量的高選擇性定量測定。

圖2 L-瓜氨酸純品(a)和L-瓜氨酸衍生物(b)的電泳圖Fig.2 Electropherograms of L-citrulline(a) and its derivative product(b)ECL peak 1 and 2 are attributed to the derivative product from formaldehyde and L-citrulline,respectively

2.2 柱前衍生反應(yīng)條件的優(yōu)化

按照對α-伯胺基進行柱前N-甲基化衍生反應(yīng)的有機反應(yīng)途徑[25-26]，將瓜氨酸轉(zhuǎn)化為含α-叔胺基的衍生產(chǎn)物主要分3個步驟：首先，在室溫下與甲醛反應(yīng)1 h使α-伯胺基通過親核加成形成氨基醇中間體；其次，通過加入NaOH將體系的pH值調(diào)至7.5左右，使氨基醇中間體在57 ℃的恒溫水浴中脫水形成亞胺中間體；第3步是將亞胺中間體再用硼氫化鈉化學(xué)還原成氨基酸的N-甲基化衍生產(chǎn)物。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，體系的pH值和脫水溫度對瓜氨酸衍生物的ECL峰高和峰形都有較大的影響。因此，本研究以100 μmol/L的L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣進行柱前衍生反應(yīng)制備測試樣，再根據(jù)其CE-ECL電泳圖的峰強度值對NaOH的加入量和衍生反應(yīng)溫度進行優(yōu)化。

2.2.1 氫氧化鈉加入量的優(yōu)化實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入的NaOH為0.08 mmol時，L-瓜氨酸衍生物的CE-ECL峰強度最大，此時體系的pH值為7.5，L-瓜氨酸衍生物電泳峰的峰形對稱，半峰寬值最小。而當(dāng)NaOH加入量大于0.08 mmol時，電泳峰強度下降且L-瓜氨酸衍生物的電泳峰出現(xiàn)分叉、峰形展寬的現(xiàn)象。因此選擇加入0.08 mmol 的NaOH。

2.2.2 衍生反應(yīng)溫度的優(yōu)化在整個衍生反應(yīng)過程中，適當(dāng)?shù)拿撍疁囟扔欣趤啺分虚g體的生成，且不會過多產(chǎn)生其它的副反應(yīng)中間體。實驗結(jié)果顯示，當(dāng)衍生反應(yīng)溫度控制在57 ℃左右時，L-瓜氨酸衍生物的電泳峰峰強度達到最大；而繼續(xù)升高反應(yīng)溫度時，其發(fā)光強度有所減小。更重要的是，若以過高的溫度進行L-瓜氨酸衍生反應(yīng)，會出現(xiàn)多個具有不同遷移時間的新發(fā)光信號峰，即有多個發(fā)光的副產(chǎn)物形成，進而將造成被測試樣中L-瓜氨酸初始濃度值與其衍生產(chǎn)物ECL強度值之間的線性響應(yīng)關(guān)系發(fā)生偏離。由此，確定最佳的衍生反應(yīng)溫度為57 ℃。

2.2.3 電泳分離添加劑的優(yōu)化由于瓜瓤組織的化學(xué)成分比較復(fù)雜，有其它氨基酸類物質(zhì)存在，為保證瓜氨酸衍生產(chǎn)物的電泳峰不受共存雜質(zhì)的干擾，本實驗采用殼聚糖內(nèi)壁修飾毛細管為分離毛細管，并在分離運行液中添加多種分離添加劑，以保證瓜氨酸的衍生峰與相鄰雜質(zhì)峰能達到基線分離。圖3的內(nèi)插圖是實際籽瓜樣品的柱前衍生CE-ECL電泳圖，可見該籽瓜樣品中瓜氨酸衍生物電泳峰的峰形尖銳、峰高明顯、出峰時間適宜，且與其它成分電泳峰之間的分離效果良好。以此實際樣品為測試物，對實際運行液中各添加組分的最佳濃度值進行優(yōu)化。最終選取32.0 mmol/L硼砂緩沖溶液(pH 8.0)為基本緩沖溶液，再添加5.0 mmol/L的SDBS、9.0 mmol/L的STPP、3.5 mmol/L的β-甲基-環(huán)糊精和4 %的甲醇組成分離運行緩沖溶液。需要注意的是，由于運行緩沖溶液中SDBS的加入量對待測物發(fā)光強度和分離度影響較大，須精確控制其加入量至5.0 mmol/L。

2.2.4 柱前衍生電致化學(xué)發(fā)光法測定瓜氨酸的分析性能在上述優(yōu)化實驗條件下，用不同濃度的L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進行柱前衍生，再分別紀(jì)錄其CE-ECL電泳圖。實驗結(jié)果表明：當(dāng)瓜氨酸反應(yīng)初始濃度為9.0～250 μmol/L時，其衍生物的電泳峰強度值與濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為IECL=-42.3+29.9ccitrulline(r2=0.999 6)，計算得檢出限為3.2 μmol/L(S/N=3)。該結(jié)果明顯優(yōu)于采用毛細管電泳-紫外吸收光譜聯(lián)用檢測法(CE-UV-Vis)的靈敏度[15]。此外，對含100 μmol/LL-瓜氨酸的衍生標(biāo)樣平行進樣6次，測得其電泳峰強度值和遷移時間值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.6%和0.92%，表明本法的精密度良好。

圖3 用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定實際瓜瓤樣品的CE-ECL電泳圖Fig.3 Electropherograms of a real melon sample by using the standard addition method spiked L-citrulline(a-e):0.0，40，80，120，160 μmol/L

2.3 實際樣品測定

實際籽瓜樣品的加標(biāo)實驗結(jié)果如圖3所示。在籽瓜瓜瓤樣品中加入不同量的L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液并進行柱前衍生后，分別紀(jì)錄其CE-ECL電泳圖，僅發(fā)現(xiàn)2號峰位置處各加標(biāo)樣的電泳峰強度值隨著加標(biāo)量的增加而逐漸增大，且此電泳峰的遷移時間和峰形均基本保持穩(wěn)定，無其他干擾峰或雜質(zhì)峰出現(xiàn)。

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對一組樣品如西瓜、籽瓜、甜瓜、哈密瓜4種瓜瓤組織中的瓜氨酸分別進行定量測定，并將測得值按瓜瓤組織鮮重為計量單位進行換算，結(jié)果見表1。可知上述幾種瓜瓤組織中瓜氨酸含量略有不同，其中西瓜瓤中瓜氨酸含量為最高，鮮重含量達到2.75 mg/g，與文獻報道值完全符合[12]。另取一組實際樣品進行加標(biāo)回收實驗，得其加標(biāo)回收率為91.4%～106%。表明用本法測定瓜氨酸的精密度和回收率均令人滿意。

表1 幾種實際樣品中瓜氨酸含量的測定結(jié)果Table 1 Determination results of citrulline content in the several real samples

3 結(jié) 論

本文基于N-甲基化衍生反應(yīng)可將瓜氨酸分子中的α-伯氨基成功轉(zhuǎn)化為α-叔氨基，從而極大增加其電致化學(xué)發(fā)光檢測靈敏度的分析原理，利用殼聚糖內(nèi)壁修飾毛細管為分離毛細管并輔以分離添加劑，成功建立了柱前衍生毛細管電泳-電致化學(xué)發(fā)光法測定瓜氨酸含量的通用性分析方法。實驗證明：此衍生方法簡單、易操作，衍生產(chǎn)物單一、穩(wěn)定，經(jīng)過衍生的瓜氨酸的ECL強度能提高200余倍。同時，該測定方法還具有選擇性好、靈敏度高、衍生試劑價格低廉等優(yōu)點，完全適用于不同種類瓜瓤組織中瓜氨酸含量的分析。