磁性納米分子印跡聚合物的制備及其對(duì)生物體內(nèi)PQQ-DA痕量產(chǎn)物的研究

毛師師，周杏琴，欽曉峰，徐希杰，謝敏浩

(江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214063)

多巴胺(DA)是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的生理作用[1-2]。吡咯并喹呤醌(PQQ)是一種氧化還原酶輔基，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳動(dòng)物中[3-4]。PQQ具有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能夠與多種活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)[5]，與DA反應(yīng)生成PQQ-DA(反應(yīng)式見(jiàn)圖1)，研究腦內(nèi)PQQ-DA含量對(duì)PQQ與多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的作用機(jī)制具有重要意義。

腦內(nèi)PQQ-DA含量屬于痕量級(jí)，一般分析方法難以檢測(cè)，而常規(guī)固相萃取吸附劑特異選擇性不足，易將其他干擾物與目標(biāo)物共同萃取下來(lái)[6]。目前尚未見(jiàn)PQQ-DA含量分析的相關(guān)報(bào)道。本文以磁性Fe3O4為內(nèi)核，四甲氧基硅烷和3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷對(duì)磁性納米粒子表面進(jìn)行包裹和修飾，將可聚合雙鍵引入Fe3O4@SiO2粒子表面，以乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑聚合反應(yīng)，形成可以進(jìn)一步被多種有機(jī)官能團(tuán)修飾的分子印跡聚合層[7-12]。以PQQ-DA為模板分子，采用分子印跡技術(shù)合成對(duì)其具有高選擇性的分子印跡聚合物，洗去模板分子后，在硅膠表面的聚合物薄層中留下了大量可匹配的空穴。由于PQQ-DA上的酰氨基與微粒表面的功能大分子之間存在靜電相互作用與吸附作用，因而可以優(yōu)先吸附與洗脫，制備了對(duì)PQQ-DA具有高識(shí)別性、高選擇性的磁性分子納米印跡材料，采用掃描電鏡和紅外光譜對(duì)其進(jìn)行了表征[14-17]，并聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS)測(cè)定腦內(nèi)痕量PQQ-DA，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和機(jī)理研究具有重要指導(dǎo)意義。

圖1 PQQ-DA的反應(yīng)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Reaction structure formula of PQQ-DA

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC(美國(guó)Waters公司)，配有SQ Detector 2質(zhì)譜檢測(cè)器及PDA檢測(cè)器；EVO18掃描電鏡(德國(guó)卡爾蔡司公司)；TENSOR 27紅外光譜儀(德國(guó) Bruker公司)；HH-2L型恒溫水浴鍋(鄭州杜普儀器廠)；S220K型酸度計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司)；BSA 224S-CW型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；T10勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司)；81-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器有限公司)；STS-8A脫色搖床(上海琪特分析儀器有限公司)；HS-3120超聲波清洗器(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；5417R冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendor公司)。

PQQ由江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所合成室提供;甲醇(色譜純，百靈威科技有限公司)；七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二異丁腈、乙二醇二甲基丙烯酸酯、K2HPO4、乙二胺四乙酸二鈉、氨水、乙醇、甲酸、醋酸、高氯酸(PCA)、NaOH(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；3-(異丁烯酰氧)苯基三甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷(Sigma公司)，氮?dú)?無(wú)錫市輝榮貿(mào)易有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

20～30 g小鼠(由常州卡文斯公司提供)按照對(duì)照組、PQQ缺損模型組和PQQ組隨機(jī)分為3組，每組6只。按照每天下午14∶00腹腔給藥，注射量為10 mL/kg(1.0 mg/mL)，連續(xù)給藥6周。實(shí)驗(yàn)小鼠喂養(yǎng)于室溫為(20±2)℃的動(dòng)物室中，自然光照射，換氣扇通風(fēng)，自由進(jìn)食飲水，提前一周適應(yīng)環(huán)境。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；離子源溫度：110 ℃；錐孔氣流量：50 L/h；毛細(xì)管電壓：3 000 V；錐孔電壓：30 V；質(zhì)譜采用電噴霧正離子模式ESI+，質(zhì)量掃描范圍為m/z0～1 000。流動(dòng)相：A為水，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～10 min,5%～70% B。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Fe3O4磁性納米粒子的制備配制100 mL 1.25 mmol/L FeSO4·7H2O溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下以800 r/min的速度機(jī)械攪拌，用6 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 10.0，1 h后磁性沉淀物分離，用磁鐵吸附黑色Fe3O4納米粒子，倒去上層液體，用二次蒸餾水及乙醇分別洗滌3次，再分散懸浮于乙醇溶液中,得到5.0 mg/mL的納米Fe3O4懸浮液。

1.4.2 磁性Fe3O4包裹SiO2的制備取上述“1.4.1”制備的納米Fe3O4懸浮液50 mL，加入5 mL氨水，5 mL二次蒸餾水，10 mL含1 mmol/L的四甲氧基硅烷，于60 ℃下以800 r/min攪拌10 h；然后加入200 μL 3-(異丁烯酰氧)苯基三甲氧基硅烷分散于50 mL 10%的醋酸水溶液中，繼續(xù)攪拌5 h，用二次蒸餾水洗滌，得到磁性Fe3O4/SiO2納米粒子。

1.4.3 PQQ-DA印跡磁性納米粒子聚合物的制備精密稱取0.46 g PQQ-DA加入30 mL含0.2 mol/L甲基丙烯酸乙二醇酯溶液，超聲混合30 min，氮?dú)獗Ｗo(hù)下滴加5.0 g乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.02 g偶氮二異丁腈，再加入0.25 g 磁性Fe3O4/SiO2納米粒子，超聲30 min；將此混合液于60 ℃下反應(yīng)24 h，得PQQ-DA印跡磁性納米粒子。非印跡磁性納米粒子的制備除了不加模板分子PQQ-DA外，其他步驟和印跡磁性納米粒子相同。將以上制備的納米粒子用乙醇-甲酸(體積比5∶1)混合液洗滌3次，再用二次蒸餾水洗滌3次，用外部磁場(chǎng)分離出磁性納米粒子，真空干燥，分別得到磁性印跡聚合物及磁性非印跡聚合物。

1.4.4 腦組織處理小鼠各組冰上取腦，分別稱重，加組織裂解液(腦組織重量/裂解液=1 g/1.5 mL)勻漿(組織裂解液含0.6 mol/L PCA和0.5 mmol/L EDTA-Na2)[13]，4 ℃下以14 000 r/min離心15 min，上清液取出再離心15 min，取出上清液，加入等體積蛋白PCA沉淀劑(含1.2 mol/L K2HPO4和2.0 mmol/L EDTA-Na2)，4 ℃冰浴放置10 min后，4 ℃下以14 000 r/min離心15 min，得含目標(biāo)物的腦組織處理液，備用。

1.4.5 磁性納米分子印跡處理取20 mg印跡磁性納米粒子分散于250 mL腦組織處理液中。15 ℃振蕩吸附1 h后，將磁鐵置于燒杯底部吸住印跡磁性納米粒子，棄去上清液；印跡磁性納米粒子用去離子水洗滌后，重新分散在5 mL乙醇-甲酸(體積比6∶1)混合溶液中并超聲10 min，將粒子用磁鐵吸至燒杯底部，取上清液，氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

采用掃描電鏡觀察分子印跡聚合物的表面(圖2)。掃描電子顯微鏡顯示(圖2A)，其顆粒大小分布均勻，大致呈圓形，粒徑約10 nm，基本滿足超順磁性顆粒的要求；接枝PQQ-DA印跡層后的掃描電子顯微鏡圖(圖2B)顯示，其粒徑約130 nm，顆粒表面呈現(xiàn)粗糙多孔的特性，適合目標(biāo)分子的釋放與結(jié)合，孔隙粒徑小于50 nm，適用于模板分子轉(zhuǎn)移，可在很短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到萃取平衡。

圖2 磁性納米粒子的掃描電子顯微鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopes of magnetic nanoparticlesA.Fe3O4/SiO2;B.PQQ-DA-Fe3O4/SiO2

圖3 紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectroscopya.non imprinted magnetic nanoparticles(非印跡磁性納米粒子);b.prior to elution of imprinted magnetic nanoparticles(印跡磁性納米粒子洗脫前);c.after elution of imprinted magnetic nanoparticles(印跡磁性納米粒子洗脫后)

2.2 紅外光譜表征

采用紅外光譜對(duì)分子印跡聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征(圖3)。與非印跡磁性納米粒子(曲線a)相比，印跡磁性納米粒子洗脫前(曲線b)PQQ-DA結(jié)構(gòu)中各特征峰明顯增強(qiáng)，其中3 444 cm-1處為-OH伸縮振動(dòng)峰，1 690 cm-1和1 650 cm-1處為酰胺特征峰，無(wú)機(jī)雜化涂層使2 935、2 855 cm-1處的酰胺基特征峰出現(xiàn)輕微位移。而當(dāng)印跡磁性納米粒子洗脫后(曲線c)，其與非印跡磁性納米粒子(曲線a)的峰形和強(qiáng)度基本一致，表明PQQ-DA能夠從印跡磁性納米粒子吸附中較好地洗脫出來(lái)，留下可以進(jìn)行分子識(shí)別的空穴。

圖4 PQQ在磁性印跡聚合物和磁性非印跡聚合物上的吸附等溫線Fig.4 Isothermal adsorption of PQQ on magnetic imprinted polymers and magnetic non imprinted polymers

2.3 吸附實(shí)驗(yàn)

精密移取5 mL質(zhì)量濃度分別為0.02、0.2、0.8、1.0、2.0、4.0 mg/mL的PQQ-DA溶液于錐形瓶中，再分別稱取15 mg磁性印跡聚合物和磁性非印跡聚合物，分散于不同濃度的PQQ-DA溶液中，于15 ℃水浴恒溫振蕩10 h后用磁鐵將粒子吸在底部，采用UPLC-MS測(cè)定上清液中PQQ-DA含量；以印跡磁性納米粒子的吸附容量對(duì)PQQ-DA濃度作圖，繪制等溫吸附線(圖4)。吸附容量(Q)為每單位質(zhì)量(g)納米粒子吸附目標(biāo)分子的質(zhì)量，由其在振蕩吸附前后PQQ-DA的濃度差值計(jì)算得到：Q=(c0-ci)V/m。式中，c0為PQQ-DA初始質(zhì)量濃度(mg/mL)，ci為振蕩后上清液中PQQ-DA質(zhì)量濃度(mg/mL)，V為溶液體積(mL)，m為粒子質(zhì)量(mg)。由吸附等溫線可見(jiàn)，低濃度時(shí)印跡粒子的吸附容量隨PQQ-DA濃度的增大而增加，在2.0 mg/mL時(shí)基本達(dá)到飽和，計(jì)算得飽和吸附容量為113.8 mg/g，是相同條件下非印跡粒子的飽和吸附容量(50.2 mg/g)的2.3倍。

2.4 印跡磁性納米粒子用量的影響

吸附劑用量對(duì)目標(biāo)物的回收率具有重要影響，若粒子用量不夠，則不能完全吸附目標(biāo)物；若粒子用量過(guò)多，雖可確保目標(biāo)物被充分吸附，但會(huì)影響洗脫從而降低提取效率。實(shí)驗(yàn)研究了不同磁性納米分子印跡粒子用量(2.5、5、10、15、20、25 mg)對(duì)PQQ-DA回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)回收率隨磁性納米分子印跡粒子用量增加而增大，在10 mg時(shí)達(dá)到最大(93.5%)，此后，繼續(xù)增加印跡磁性納米粒子用量，回收率反而下降。因此，選擇10 mg為印跡磁性納米例子的最佳用量。

2.5 脫附時(shí)間的影響

脫附時(shí)間對(duì)回收率也有很大影響，為了獲得最佳脫附時(shí)間，實(shí)驗(yàn)將吸附飽和的印跡磁性納米粒子分散于2 mL乙醇-甲酸(體積比8∶2)溶液中，于搖床中振蕩洗脫，考察不同振蕩洗脫時(shí)間(5、10、15、20、30、40 min)的回收率。結(jié)果顯示，回收率隨著洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，在洗脫時(shí)間為20 min時(shí)達(dá)到最大(93.6%)，此后，洗脫達(dá)到平衡。因此，在實(shí)際樣品分析時(shí)選擇20 min為最佳洗脫時(shí)間。

圖5 PQQ-DA的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrogram of PQQ-DA

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 線性范圍與檢出限精密稱取一定量PQQ-DA，用二次蒸餾水配制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取10 mg印跡磁性納米粒子分散于250 mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液中，于15 ℃振蕩吸附1 h后，以磁鐵置于燒杯底部將印跡磁性納米粒子吸住，棄除上清液；印跡磁性納米粒子用去離子水洗滌后，重新分散在5 mL乙醇-甲酸(體積比6∶1)混合溶液中，再超聲20 min，粒子用磁鐵吸至燒杯底部，取上清液稀釋，進(jìn)UPLC-MS在優(yōu)化條件下分析。以PQQ-DA質(zhì)量濃度(x,mg/mL)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為y=1 205 519 606x+259 487(r2=0.996 6)，以3倍信噪比(S/N≥3)計(jì)算得其檢出限(LOD)為0.2×10-11mg/mL。

2.6.2 精密度及回收率在優(yōu)化條件下，對(duì)腦組織樣品分別進(jìn)行0.2、0.6、1.0 mg/mL水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算得加標(biāo)回收率為88.7%～95.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.6%～3.2%。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

按照“1.4.4”方法處理小鼠腦組織，在優(yōu)化條件下進(jìn)樣測(cè)定，經(jīng)MS圖譜確認(rèn)466.25 M+為PQQ-DA分子離子峰(圖5)。將其色譜峰積分面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得PQQ-DA含量(c，mg/mL)，再根據(jù)c×V(進(jìn)樣體積)/m(腦組織重量)計(jì)算得到正常小鼠腦組織中PQQ-DA含量為(0.25±0.006)ng/mg，而PQQ缺損模型鼠中未檢出PQQ-DA，連續(xù)注射PQQ (1.0 mg/mL) 6周后的小鼠腦組織中PQQ-DA含量為(1.09±0.012)ng/mg。

3 結(jié) 論

本文制備了PQQ-DA印跡磁性納米粒子聚合物，并優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，建立了UPLC-MS檢測(cè)小鼠腦內(nèi)痕量PQQ-DA的分析方法。該方法特異性強(qiáng)、選擇性好，未來(lái)有望運(yùn)用到疾病的診斷和治療中。