鄭心彤 凌霄雁 古賢君 林 栩 黃海庭 吳好好 鐘秋紅 尤燕舞 唐奇燎

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，百色533000)

足細(xì)胞錨定在腎小球基底膜上，維持著腎小球的結(jié)構(gòu)，是腎小球濾過膜的重要組成部分。足細(xì)胞數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)及功能異?？蓪?dǎo)致蛋白尿并最終發(fā)展為腎小球硬化，參與了許多腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的過程。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一種內(nèi)源性小分子非編碼RNA，其生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮，主要是通過與靶基因3′非翻譯區(qū)結(jié)合，從而實現(xiàn)對靶蛋白的調(diào)節(jié)。生物信息學(xué)研究結(jié)果表明，人類miRNA的靶基因至少有上千個，而受miRNA調(diào)控的靶基因更是達(dá)五千多個，廣泛參與了機體生理、病理調(diào)控的各個過程[1]。Dicer敲除小鼠模型中，小鼠出現(xiàn)大量蛋白尿和嚴(yán)重的腎損害，足細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生改變，這使學(xué)者們注意到miRNA與足細(xì)胞間的關(guān)系[2]。

本研究采用轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor，TGF)-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，通過建立不同濃度、不同時間梯度TGF-β1干預(yù)組，檢測各組足細(xì)胞損傷標(biāo)志物synaptopodin、CD2AP的mRNA、蛋白表達(dá)以及足細(xì)胞中miR-155的表達(dá)變化，從而探索miR-155與足細(xì)胞損傷之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 腎小球足細(xì)胞株(MPC5)購于上海復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞中心，RPMI1640 培養(yǎng)基(美國Gibco)、胎牛血清(中國Cellmax)、重組人TGF-β1(美國PeproTech)、synaptpotodin抗體(21064-1-AP)、CD2AP抗體(51046-1-AP)、GAPDH抗體(10494-1-AP)(美國Proteintech)，磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑混合物(北京康為世紀(jì))，BCA蛋白定量試劑盒(中國碧云天公司)，RNAiso Plus RNA提取試劑盒(9108)、SYBR Premix Ex TaqTMII(RR820A)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)，(日本TaKaRa)，Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit (638315，美國clontech)，PCR引物合成(大連寶生物工程有限公司)，引物序列見表1(miR-155引物序列為其專利，U6引物由clontech試劑盒提供，均不提供具體堿基序列)，CCK8 試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)。

1.2方法

1.2.1足細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)方法參照本課題組的前期研究，并稍作修改[3]。細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2環(huán)境中傳代培養(yǎng)。2～3 d換液 1 次。細(xì)胞融合至80%左右消化傳代，14 d左右分化成熟后用于相關(guān)實驗。

1.2.2TGF-β1處理及分組 細(xì)胞傳代后，以0.4～1×105個細(xì)胞種于6孔板中，待各組細(xì)胞融合至60%～70%后用含1%胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液同步化24 h不同濃度TGF-β1作用72 h分組：0 ng/ml組、4 ng/ml組、8 ng/ml組、12 ng/ml組。12 ng/ml TGF-β1作用不同時間分組：0 h組、24 h組、48 h組、72 h組。提取總RNA、總蛋白。

1.2.3CCK8法檢測細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞按 1×104個/孔接種于96孔板，每孔終體積為100 μl，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)置空白孔。24 h待細(xì)胞貼壁以后更換原培養(yǎng)液，向培養(yǎng)板各組細(xì)胞加入相應(yīng)濃度梯度含TGF-β1的培養(yǎng)液。在培養(yǎng)箱中孵育到各自時間點后，每孔加入10 μl CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(OD)。細(xì)胞存活率=[(實驗組OD值-空白組OD值)÷(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.2.4Real-time RT-PCR檢測 按照說明用 RNAiso Plus提取各實驗組小鼠足細(xì)胞的總RNA。經(jīng)紫外分光光度計測定OD260、OD280及RNA濃度、瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用LightCycler?96 實時熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。選取GAPDH和U6作為mRNA和miRNA的內(nèi)參，檢測miR-155、U6、synaptopodin、CD2AP、GAPDH的mRNA表達(dá)。以2-ΔΔCT法計算相對表達(dá)量，ΔΔCT=(CT實驗組目的-CT實驗組內(nèi)參)-(CT對照組目的-CT對照組內(nèi)參)。

1.2.5Western blot法檢測 收集處理好的各實驗組足細(xì)胞，提取總蛋白。以二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，取30～50 μg蛋白加入5×SDS上樣緩沖液煮沸變性后，于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 mA恒流濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h，分別加入一抗稀釋液稀釋的synaptopodin(1∶500)、CD2AP(1∶500)、GAPDH(1∶2 000)抗體，4℃孵育過夜，洗滌3次，加入相應(yīng)的抗兔IgG-HRP二抗，室溫孵育1 h，洗滌3次，增強化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，利用Image J軟件進(jìn)行半定量分析，以目的條帶與同個樣品GAPDH灰度值的比值表示相對光密度值。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

Tab.1 Primers of qRT-PCR

NameForward primer(5′-3′)Reverse primer(5′-3′)SynaptopodinGCTCGAATTCCGATGCAAATAAACCAGGCCACAGTGAGATGTGAAGACD2APAGGAATTCAGCCACATCCACACGATCAATTCCAGTTCGTCCTCGAPDHTGTGTCCGTCGTGGATCTGATTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG

2 結(jié)果

2.1TGF-β1干預(yù)對體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞增殖活性的影響 不同劑量的TGF-β1(4、8、12 ng/ml)作用于足細(xì)胞，干預(yù)時間為24 h時對細(xì)胞增殖活性的影響不大(P>0.05)，但從48 h開始細(xì)胞存活率不同程度降低，細(xì)胞增殖活性受到抑制，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.2TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷對miR-155表達(dá)的影響 正常對照組中miR-155的表達(dá)量較低，使用8、12 ng/ml TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞72 h后，miR-155表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而4 ng/ml組與正常對照組miR-155相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。使用12 ng/ml TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞48、72 h后，miR-155表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而24 h組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

2.3TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷對synaptopodin、CD2AP mRNA表達(dá)的影響 與正常對照組相比，8、12 ng/ml TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞72 h后，synaptopodin、CD2AP mRNA表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)。4 ng/ml組與正常對照組synaptopodin、CD2AP mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表4)。12 ng/ml TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞48、72 h后， synaptopodin、CD2APmRNA表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)。當(dāng)24 h組與正常對照組synaptopodin、CD2AP mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表5)。

圖1 TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞后的細(xì)胞存活率Fig.1 Cell survival rate of TGF-β1 on podocyteNote: Compared with the 0 ng/ml group,# .P<0.01.

GroupsnmiR-1550 ng/ml31.00±0.004 ng/ml31.21±0.088 ng/ml31.71±0.101)12 ng/ml32.20±0.122)

Note：Compared with the 0 ng/ml group,1)P<0.05,2)P<0.01.

2.4TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后對synaptopodin、CD2AP蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組相比，8、12 ng/ml TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞72 h后，synaptopodin、CD2AP蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)，4 ng/ml組與正常對照組synaptopodin、CD2AP蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。12 ng/ml TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞48、72 h后，synaptopodin、CD2AP 蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)，24 h組與正常對照組synaptopodin、CD2AP 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

GroupsnmiR-1550 h31.00±0.0024 h31.07±0.1648 h31.29±0.051)72 h32.00±0.062)

Note：Compared with the 0 h group,1)P<0.05,2)P<0.01.

GroupsnSynaptopodin mRNACD2AP mRNA0 ng/ml31.00±0.001.00±0.004 ng/ml30.83±0.070.94±0.038 ng/ml30.62±0.041)0.66±0.061)12 ng/ml30.30±0.022)0.47±0.012)

Note：Compared with the 0 ng/ml group,1)P<0.05,2)P<0.01.

GroupsnSynaptopodin mRNACD2AP mRNA0 h31.00±0.001.00±0.0024 h30.78±0.100.78±0.1248 h30.60±0.081)0.63±0.041)72 h30.30±0.012)0.47±0.012)

Note：Compared with the 0 h group,1)P<0.05,2)P<0.01.

2.5Pearson相關(guān)分析 不同濃度、不同時間TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞，synaptopodin蛋白與mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.921、0.941，CD2AP蛋白與mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.753、0.879，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。不同濃度、不同時間TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞，synaptopodin蛋白與miR-155表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為-0.907、-0.962；CD2AP蛋白與miR-155表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為-0.794、-0.819，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖5)。不同濃度、不同時間TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞，synaptopodin mRNA與miR-155表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為-0.985、-0.925，CD2AP mRNA與miR-155表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為-0.963、-0.832，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖6)。

圖2 不同濃度TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞對synaptopodin、CD2AP 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of TGF-β1 on synaptopodin,CD2AP protein expression in podocyte at different concentrationNote: A.Western blot;B.A summary graph for the densitometry values of the target protein.Compared with the 0 ng/ml group,*.P<0.05,#.P<0.01.

圖3 TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞不同時間對Synaptopodin、CD2AP 蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of different times of TGF-β1 on synaptopodin,CD2AP protein expression in podocyteNote: A.Western blot;B.A summary graph for the densitometry values of the target protein.Compared with the 0 h group,*.P<0.05,#.P<0.01.

圖4 Synaptopodin、CD2AP蛋白和mRNA的相關(guān)性Fig.4 Correlation between synaptopodin,CD2AP protein and mRNA

圖5 Synaptopodin、CD2AP蛋白和miR-155的相關(guān)性Fig.5 Correlation between synaptopodin,CD2AP protein and miR-155

圖6 Synaptopodin、CD2AP mRNA和miR-155的相關(guān)性Fig.6 Correlation between synaptopodin,CD2AP mRNA and miR-155

3 討論

足細(xì)胞是腎小球濾過膜的重要組成部分，許多腎臟疾病均出現(xiàn)不同程度的足細(xì)胞損傷[4]。骨架蛋白功能和結(jié)構(gòu)的改變，是足細(xì)胞損傷的中心環(huán)節(jié)。TGF-β1是足細(xì)胞損傷常見的炎癥因子之一，參與了腎臟疾病腎小球硬化的過程，在體外培養(yǎng)的足細(xì)胞損傷模型中被廣泛應(yīng)用。TGF-β1損傷足細(xì)胞的過程與核因子kappa-B、磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B、絲裂原活化蛋白激酶等通路的激活有關(guān)[5,6]。本研究使用TGF-β1構(gòu)建足細(xì)胞損傷模型，對其具體機制進(jìn)一步探究。使用不同濃度、不同時間梯度的TGF-β1干預(yù)足細(xì)胞并采用CCK8法檢測其增殖活性，結(jié)果顯示，一定濃度的TGF-β1可抑制足細(xì)胞增殖，從而降低細(xì)胞存活率，這與我們課題組之前的研究結(jié)果一致[7]。

成熟的miRNA可通過促進(jìn)降解或抑制翻譯在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)水平，廣泛參與了細(xì)胞增殖凋亡、人體病理生理以及疾病發(fā)展預(yù)后等過程。由于尿液中的miRNA被包裹在囊泡中表達(dá)相對穩(wěn)定，這使得miRNA有望成為新的診斷標(biāo)志物[8]。近年來，越來越多的研究表明miRNA與腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的過程密切相關(guān)[9,10]。此外，在第十一屆國際足細(xì)胞會議中，許多學(xué)者對足細(xì)胞中miRNA的重要作用做出總結(jié)，有學(xué)者檢測到膜性腎病患者的足細(xì)胞中存在多種特異性miRNAs，糖尿病患者足細(xì)胞中miR-146a的差異表達(dá)與免疫系統(tǒng)失調(diào)密切相關(guān)；新月體性腎炎患者的足細(xì)胞中miRNA92a表達(dá)上調(diào)并調(diào)控足細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p57最終導(dǎo)致細(xì)胞靜止，miRNA92a靶基因之一轉(zhuǎn)錄激活子3也在多種腎小球疾病中表達(dá)上調(diào)[11]。眾多miRNA中，miR-155和miR-146與免疫應(yīng)答關(guān)系密切，也是研究最多的[12]。然而，miR-155在腎臟疾病中作用的研究較少。有研究顯示，與健康對照組相比，狼瘡腎炎患者的腎臟組織中miR-155的表達(dá)上調(diào)[13]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，腎小球疾病患者出現(xiàn)了足細(xì)胞損傷及miR-155表達(dá)上調(diào)，miR-155敲除小鼠模型中足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin乙酰化，腎臟損害減輕，這表明miR-155在足細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮重要作用，可能是腎臟疾病足細(xì)胞損傷診斷和治療的潛在靶點[14]。然而miR-155在TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中表達(dá)如何變化及其可能的分子機制仍不明確。本研究，我們采用Real-time RT-PCR檢測miR-155的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型中，miR-155的表達(dá)水平上調(diào)，并且在一定范圍內(nèi)呈劑量、時間依賴性，這提示我們，miR-155可能參與了TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的過程。

synaptopodin是分化成熟足細(xì)胞的骨架蛋白之一，和緊密連接蛋白MAGI-1一起與動蛋白微絲緊密相連，可將足細(xì)胞肌動蛋白骨架從活動性轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s性，維持足細(xì)胞的功能結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定腎小球濾過[15]。synaptopodin表達(dá)變化將影響足細(xì)胞的生理功能，改變腎小球濾過膜的通透性并導(dǎo)致蛋白尿。CD2AP銜接著T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)時被認(rèn)為是免疫分子又被稱為“免疫突觸”，而后證實CD2AP在多種組織中均有表達(dá)，在腎臟中主要分布于足細(xì)胞，包埋在足細(xì)胞裂孔隔膜的脂筏中[16]。CD2AP不僅在足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的維持中發(fā)揮重要作用，還維持著免疫系統(tǒng)穩(wěn)定。當(dāng)synaptopodin、CD2AP表達(dá)發(fā)生變化，意味著足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能改變。然而在TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型中，synaptopodin和CD2AP表達(dá)如何變化及其與足細(xì)胞中miR-155表達(dá)變化的關(guān)系，至今未見報道。本研究結(jié)果證實，TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的過程中，synaptopodin和CD2AP mRNA和蛋白的表達(dá)均下調(diào)，并且在一定范圍內(nèi)呈劑量、時間依賴性，這與先前的理論、研究以及預(yù)測的實驗結(jié)果相一致，TGF-β1成功誘導(dǎo)構(gòu)建了足細(xì)胞損傷模型。通過Pearson相關(guān)分析我們發(fā)現(xiàn)，synaptopodin、CD2AP的mRNA和蛋白表達(dá)呈正相關(guān)且均與miR-155的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這充分說明了miR-155的表達(dá)水平可能與足細(xì)胞的損傷程度有關(guān)。

足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整和功能正常對維持腎臟生理功能至關(guān)重要，miR-155廣泛調(diào)控基因表達(dá)，其靶基因與足細(xì)胞損傷的多條信號通路相關(guān)[17]。我們的研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷使足細(xì)胞增殖抑制，synaptopodin、CD2AP mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，miR-155表達(dá)上調(diào)，miR-155可能是參與TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的重要因子，對腎臟疾病發(fā)病機理的研究至關(guān)重要。然而，miR-155在足細(xì)胞損傷中的具體機制有哪些，在臨床腎臟疾病的防治中如何運用，我們課題組將進(jìn)行更深入地研究。