嚴(yán)俊杰 楊綺玲 林藝君 石路懷 王 宏 唐 勇

(暨南大學(xué),廣州510632)

藍(lán)耳病毒是危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要的單鏈RNA病毒，它的RNA長約15 Kb，包含10個開放閱讀框，分別是ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6、ORF7[1]。其中ORF1編碼2個大的多聚體蛋白，這兩個蛋白可以裂解為14個非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。而ORF2a、ORF2b、ORF3～7和ORF5a 則編碼8個結(jié)構(gòu)蛋白分別為糖蛋白GP2、包膜蛋白E蛋白、GP3、GP4、GP5、M、N和ORF5a蛋白[3]。其中GP5和M蛋白可以形成二聚體，而GP2、GP3、GP4可以形成三聚體并協(xié)助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[4]。根據(jù)核苷酸序列分析可把藍(lán)耳病毒分為兩種基因型，歐洲型和北美型，他們的基因相似性只有63%[5]。此外即使是同一基因型的病毒，他們的基因依然存在一定的差異，所以存在眾多抗原性不同的藍(lán)耳病毒。

藍(lán)耳病毒可使豬患上豬繁殖呼吸綜合征(Porcine reproductive respiratory syndrome virus,PRRSV)，讓妊娠母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎，幼齡仔豬出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難等癥狀[6]，所以豬繁殖呼吸綜合征使世界養(yǎng)豬業(yè)蒙受巨大的損失。因此，建立一種穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高的檢測藍(lán)耳病毒的方法十分有必要。目前比較普遍的檢測方法主要是分子生物學(xué)檢測和血清學(xué)檢測，由于分子生物學(xué)檢測需要儀器和相關(guān)技術(shù)人員，不能做到現(xiàn)場大規(guī)模檢測。而血清水平上有多種檢測方法例如ELISA，膠體金試紙條等，這些方法簡單快捷，不需要相關(guān)技術(shù)人員，并且可以現(xiàn)場大規(guī)模檢測。

NSP7是PRRSV病毒的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，與NSP6和NSP8相鄰。NSP7能被NSP4蛋白酶從內(nèi)部裂解成NSP7α和NSP7β兩部分[7]。 Brown等[8]研究結(jié)果表明在非結(jié)構(gòu)蛋白中非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1、NSP2、NSP7的免疫活性最高，豬在感染藍(lán)耳病毒后大約14 d就可以產(chǎn)生高水平的針對NSP7的抗體,與N蛋白抗體水平相似。另外據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，藍(lán)耳病毒各株NSP7蛋白同源性較高，針對NSP7的抗體在豬體內(nèi)可以持續(xù)202天[9]。由于PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7相對保守,不同毒株之間差異較小,所以它可以在檢測抗體時保持較高的特異性[7]。因此可以用NSP7作為靶蛋白檢測血清中是否有相關(guān)抗體，以此來判斷是否有藍(lán)耳病毒感染。

本文應(yīng)用生物信息學(xué)對NSP7基因進(jìn)行分析；然后對重組蛋白基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化以期提高重組蛋白的表達(dá)量和可溶性表達(dá)；隨后對重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析優(yōu)化，鎳柱純化，最后用間接ELISA法和Western blot鑒定純化的重組蛋白是否具有免疫學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1材料 所用菌株BL21-PET32a 為本實驗室保存；PET32a-NSP7在蘇州泓迅生物科技有限公司合成；蛋白質(zhì)marker購自賽默飛生物技術(shù)有限公司；組氨酸標(biāo)簽鼠抗購自廣州佳研生物科技有限公司；IPTG 購自生工生物有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)化學(xué)分析純；

1.2方法

1.2.1NSP7蛋白同源性比較和抗原表位預(yù)測 DNAMAN軟件對28株藍(lán)耳病毒NSP7蛋白進(jìn)行同源性分析，在線網(wǎng)站http://www.iedb.org/分析重組NSP7蛋白的抗原表位。

1.2.2重組蛋白密碼子優(yōu)化 在線網(wǎng)站http://biotech.ou.edu/分析重組NSP7可溶性表達(dá)概率，利用NGCodon優(yōu)化軟件對NSP7基因進(jìn)行CAI-密碼子適應(yīng)指數(shù)，GC含量和mRNA二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和優(yōu)化。

1.2.3BL21-PET32a-NSP7表達(dá)鑒定及表達(dá)條件優(yōu)化 分別將50 μl過夜培養(yǎng)物菌液BL21-PET32a-NSP7 接種到5 ml含抗生素的LB培養(yǎng)基，通過測量OD值將細(xì)菌培養(yǎng)到對數(shù)生長期后根據(jù)以下要求進(jìn)行實驗以確定最佳表達(dá)條件(皆以BL21-PET32a為對照)：①37℃ 1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，確定表達(dá)產(chǎn)物存在形式。②1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h,溫度設(shè)定25℃、28℃、31℃、34℃,37℃ 5個水平，確定培養(yǎng)溫度。③34℃誘導(dǎo)7 h，IPTG濃度設(shè)定0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 5 個水平，確定IPTG作用濃度。④用上述實驗確定的最佳IPTG作用濃度、培養(yǎng)溫度，時間設(shè)定4、5、6、7、8 h 5個水平，確定培養(yǎng)時間。

1.2.4重組蛋白的純化 BL21-pET32a-NSP7重組菌于0.8 mmol/L IPTG,34℃大量誘導(dǎo)表達(dá)7 h后，離心收集菌體并溶于PBS，使用超聲破碎儀將菌液破碎40 min(pulse-on time 3 s,pulse-off time 4 s),隨后離心收集上清。將上清進(jìn)行過濾除雜后通進(jìn)鎳柱中，用一步純化法純化(先用30 mmol/L咪唑除雜后直接用250 mmol/L咪唑純化)并進(jìn)行凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.5純化蛋白的免疫學(xué)活性鑒定 Western blot鑒定：BL21-PET32a-NSP7和BL21-PET32a 菌株在37℃ 0.8 mmol/L IPTG濃度下誘導(dǎo)7 h后超聲破碎取上清，變性處理，進(jìn)行SDS-PAGE然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后用5%脫脂奶粉封閉3 h，加入TP株三免血清(1∶2 500稀釋)，4℃孵育過夜，洗膜，加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶2 500稀釋)，37℃孵育1 h，洗膜，曝光。

間接ELISA鑒定：將純化的NSP7蛋白100 ng/孔包板，以PRRSV CH-1α株三免小鼠血清作為一抗。8周齡SPF小鼠(未注射過其他藥物)陰性血清作為陰性對照，PBS作為空白對照，進(jìn)行間接ELISA檢測，驗證重組蛋白的免疫學(xué)活性。

2 結(jié)果

2.1NSP7蛋白同源性比較及抗原表位預(yù)測 DNAMAN軟件分析顯示，28株藍(lán)耳病毒同源性高達(dá)99.25%,預(yù)示著NSP7是一個相對保守的蛋白，抗原表位預(yù)測顯示NSP7蛋白上具有多個B細(xì)胞表位(表1)，可以刺激機體產(chǎn)生眾多抗體，綜合以上條件NSP7蛋白可以作為一個理想的檢測藍(lán)耳病毒靶蛋白。于是挑選保守性高的TP株NSP7基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成，合成的NSP7基因與PET32a相連后轉(zhuǎn)入BL21。

2.2重組蛋白密碼子優(yōu)化 在線網(wǎng)站http://biotech.ou.edu/分析重組NSP7可溶性表達(dá)概率為0，由于蛋白穩(wěn)定性、mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率對蛋白產(chǎn)量和可溶性起主要作用所以在不改變NSP7氨基酸序列的前提下，綜合考慮NSP7基因的(G+C)%含量、CAI-密碼子適應(yīng)指數(shù)、mRNA二級結(jié)構(gòu)等因素，對目的基因進(jìn)行優(yōu)化以期增加重組蛋白的表達(dá)量和讓重組蛋白可溶性表達(dá)。由于較低的GC含量有利于提高重組蛋白的表達(dá)量和利于提高可溶性表達(dá)的概率，于是利用NGTMCodon優(yōu)化軟件分析藍(lán)耳病毒NSP7未優(yōu)化前的基因GC含量為52%(圖1B)，優(yōu)化后GC含量為51%(圖1A)。如果基因的同義密碼子與表達(dá)宿主的密碼子偏好性相匹配的話可以在一定程度上提高重組蛋白的表達(dá)量，所以利用NGTMCodon優(yōu)化軟件分析優(yōu)化藍(lán)耳病毒NSP7基因，由圖可見未優(yōu)化的NSP7基因CAI(Codon Adaption Index)只有0.58(圖1D)，優(yōu)化后的基因CAI(Codon Adaption Index)為0.81(圖1C)。mRNA二級結(jié)構(gòu)是另一影響翻譯過程的因素，如表2所示：NSP7基因未優(yōu)化前小發(fā)卡、中發(fā)卡、大發(fā)卡分別為5個、3個、2個，經(jīng)過軟件優(yōu)化后小發(fā)卡只有2個而中發(fā)卡和大發(fā)卡皆為0。

表1 表位預(yù)測

Tab.1 Predicted peptides

No.StartEndPeptideLength1106142VVDPTPTPPPAPVPIPLPPKVLENGPNAWGDEDRLNK372162172QKFWDKNSGDV113178183HNNTDE64189201VGDPADFDPEKGT135215222VYTSPSGK86228237VNPENGRVQW10

圖1 密碼子偏好性分析(A,B)及密碼子GC含量分析(C,D)Fig.1 Codon bias analysis(A,B)and GC content analysis(C,D)Note: A.Plot of GC content of optimized gene；B.Plot of GC content of wild-type gene；C.Plot of codons usage of optimized gene；D.Plot of codons usage of wild-type gene.

2.3BL21-PET32a-NSP7探究表達(dá)產(chǎn)物存在形式及表達(dá)條件優(yōu)化 ①探究表達(dá)產(chǎn)物存在形式：SDS-PAGE 檢測實驗結(jié)果顯示(圖2A)，BL21-PET32a-NSP7在37℃、1.0 mmol /L IPTG 濃度作用下誘導(dǎo)7 h目的蛋白(49 KD)為可溶性表達(dá);②最佳誘導(dǎo)溫度的確定:BL21-PET32a-NSP7 于IPTG 濃度為1.0 mmol/L、不同溫度下表達(dá)7 h，所得實驗結(jié)果如(圖2B) 所示；通過灰度分析得出溫度在34℃時目的蛋白NSP7 表達(dá)量最高；③最佳 IPTG 誘導(dǎo)濃度的確定:BL21-PET32a-NSP7于34℃不同IPTG 濃度下誘導(dǎo)表達(dá)7 h,所得實驗結(jié)果如(圖2C)所示，通過灰度分析得出IPTG 誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol /L 目的蛋白NSP7表達(dá)量最高；④最佳誘導(dǎo)時間的確定:BL21-PET32a-NSP7于34℃ IPTG 誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L 條件下，通過改變誘導(dǎo)時間所得實驗結(jié)果如(圖2D)所示，通過灰度分析得出誘導(dǎo)表達(dá)7 h目的蛋白NSP7 表達(dá)量最高。

2.5重組蛋白的純化 BL21-PET32a-NSP7菌株于最佳表達(dá)條件下大量表達(dá)，經(jīng)過超聲破碎后離心取上清，上清經(jīng)鎳柱純化后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示在49 kD處條帶較濃(圖2E)。

2.6NSP7免疫學(xué)活性的鑒定 Western blot鑒定：BL21-PET32a-NSP7與BL21-PET32a菌株破碎產(chǎn)物以抗組氨酸標(biāo)簽抗體作為一抗進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示BL21-PET32a-NSP7成功表達(dá)了我們需要的蛋白(圖2F)。ELISA鑒定：將制備的PRRSV CH-1α株多克隆抗血清以不同比例稀釋后作為一抗進(jìn)行間接ELISA 檢測。結(jié)果如表3 所示，抗血清可以與純化后的NSP7進(jìn)行特異結(jié)合，證實了NSP7蛋白具有較好的免疫學(xué)活性；按照酶標(biāo)儀檢測的OD450值P/N>2.1 的評判標(biāo)準(zhǔn)，NSP7能夠區(qū)分藍(lán)耳病毒的最大稀釋濃度為1∶6 400。

表2 發(fā)卡結(jié)構(gòu)分析

Tab.2 Hairpins analysis

HairpinsOptimizedWild-typeSmall Hairpins25Medium Hairpins03Large Hairpins02

圖2 NSP7表達(dá)形式鑒定及表達(dá)條件優(yōu)化Fig.2 Expression forms and optimisation of NSP7 expression conditionNote: A.The Soluble validation of NSP7.Lane M.Marker;Lanes 1-2.The thallus of nsp7;Lanes 3,5.Negative control;Lanes 4,6.The induced supernatant of nsp7;B.The effects of temperature gradient on the expression of nsp7.Lane M.Marker;Lane 1.Negative control;Lanes 2-6.NSP7 induced with different temperature(25℃， 28℃， 31℃， 34℃， 37℃);C.The effects of IPTG concentrations on the expression of nsp7.Lane M.Marker;Lanes 1-5.NSP7 induced with different IPTG concentrations(0.2，0.4，0.6， 0.8， 1.0 mmol/L);6.Negative control;D.The effects of induction time on the expression of nsp7.Lane M.Marker;Lanes 1-5.NSP7 induced with different times(4，5，6，7，8 h);6.Negative control;E.The purification of NSP7；Lane M.Marker;Lane 1.The induced supernatant of NSP7;Lane 2.Negative control;Lane 3.The purification of NSP7;F.Detection of purified protein by PRRSV(TP) anti-serum.Lane 1.The anti-PRRSV(TP) serum;Lane 2.Negative serum.

表3 免疫學(xué)活性檢測

Tab.3 Immunological activity detection

Serum dilution factorNegative serumPositive serum P/N4000.2611.0143.898000.1920.8364.351 6000.1690.6533.863 2000.1450.4543.136 4000.1330.3112.3412 8000.1400.2331.6625 6000.1130.1651.46Negative Control0.0980.1011.03Standard deviation0.0500.3301.27

3 討論

PRRSV已經(jīng)成為全球豬產(chǎn)業(yè)最重要的病毒病原體之一，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[6]。PRRSV不但可使母豬繁殖失敗，它還可以感染雄豬的生殖器官[10,11]，使雄豬的性欲喪失和改變其精子質(zhì)量，包括降低精子能動性和增加形態(tài)異常的頻率[12]，有文獻(xiàn)報道感染PRRSV的雄豬可以在其精液中最短連續(xù)4 d最長連續(xù)92 d檢測出PRRSV[13]，由此看來PRRSV可以通過雄性的精液作為媒介而進(jìn)行傳遞[14]，由于人工授精在全球的豬產(chǎn)業(yè)被廣泛應(yīng)用，因此有效的檢測精液中是否含有PRRSV是一個亟待解決的問題。PRRS的發(fā)病率逐年上升，對養(yǎng)豬業(yè)的危害越來越大，有效的檢測和預(yù)防該病能在最大程度上降低該病給養(yǎng)殖業(yè)帶來的巨大的經(jīng)濟損失。目前市面上主流的檢測PRRSV的試劑盒是IDEXX HerdChekPRRSELISA試劑盒，它選用免疫原性強且突變率低的N蛋白為靶蛋白，雖然檢測準(zhǔn)確率在90%以上但是存在假陽性[15]，因此需要尋找另外一種蛋白作為靶標(biāo)以檢測PRRSV。而NSP7具備作為一種合適的靶標(biāo)蛋白以檢測PRRSV的條件。NSP7是協(xié)助PRRSV RNA復(fù)制的重要蛋白[16]。宿主感染PRRSV后可以產(chǎn)生強烈的針對NSP7的免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生高滴度的特異性抗體，這種抗體最早可在感染后14 d檢出并可維持202 d[8]。有相關(guān)文獻(xiàn)報道，以NSP7作為靶標(biāo)蛋白構(gòu)建的ELISA試劑盒具有很高的敏感性和特異性，而且可以糾正98%由IDEXX ELISA試劑盒檢測的假陽性樣本[8]。

重組蛋白的表達(dá)形式一般有兩種，一種是具有一定空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的可溶性形式，另一種是無生物學(xué)活性的包涵體[17]。GC含量直接影響著DNA序列的結(jié)合穩(wěn)定性，退火溫度，mRNA熱力學(xué)穩(wěn)定性和mRNA二級結(jié)構(gòu)。如果基因的GC含量較低的話有利于提高重組蛋白的表達(dá)量和提高重組蛋白的可溶性表達(dá)概率。不同物種在翻譯的時候具有密碼子偏好性，也就是不同物種對同義密碼子的使用頻率不同。若要提高蛋白的表達(dá)水平，可對基因的同義密碼子進(jìn)行優(yōu)化使其與表達(dá)宿主的密碼子偏好性相匹配。匹配程度常用密碼子適應(yīng)指數(shù) (Codon Adaption Index)來表示，通常情況下，CAI≥0.80被認(rèn)為是預(yù)測重組蛋白高效表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。mRNA二級結(jié)構(gòu)是另一重要的影響翻譯過程的因素，復(fù)雜穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)會影響翻譯過程的順利進(jìn)行，其中影響翻譯的mRNA二級結(jié)構(gòu)主要為發(fā)卡結(jié)構(gòu)(Hairpin)[10]。

本文應(yīng)用生物信息學(xué)對NSP7基因進(jìn)行分析顯示NSP7基因具有較高的保守性但是可溶性表達(dá)概率為0，然后對重組蛋白基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化以期提高重組蛋白的表達(dá)量和使其可溶性表達(dá)，隨后對重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，鎳柱純化，Western blot和ELISA鑒定。Western blot和間接ELISA法鑒定純化的重組蛋白具有免疫學(xué)活性，為PRRSV血清學(xué)鑒定奠定了基礎(chǔ)。