江義霞 李匡政 席云祝 劉 青 賈遠航

(南華大學附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，衡陽421001)

非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是當前全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，明確其發(fā)病機制是對該病進行治療的關鍵[1，2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要和起始環(huán)節(jié)[3]。Ephrin B2作為酪氨酸激酶受體/配體家族中的一員，其能夠通過細胞間的相互排斥作用，對神經(jīng)元細胞和血管的形成和發(fā)育起調(diào)控作用[4]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2在多種腫瘤中均存在異常表達現(xiàn)象，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈明顯正相關[5]。但Ephrin B2表達與NSCLC發(fā)生和發(fā)展的關系尚未見報道。因此，本研究旨在通過檢測肺癌和癌旁正常肺組織中Ephrin B2以及標記蛋白和與促腫瘤轉(zhuǎn)移因子的表達，探討Ephrin B2與NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移之間的關系。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 收集我院病理科10年間肺癌手術切除蠟塊標本98例，同時取癌旁正常肺組織蠟塊34例作為對照。98例NSCLC患者中，男67例，女31例，年齡41～75歲，鱗癌59例，腺癌33例，有淋巴結轉(zhuǎn)移者58例，無淋巴結轉(zhuǎn)移者40例，依據(jù)2009年國際肺癌研究協(xié)會(International Association for the Study of Lung Cancer,IASLC)第七版分期標準：Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ期45例。本研究所有入組標本臨床資料及隨訪完整，并經(jīng)我院倫理委員會審批同意。

1.1.2主要試劑 山羊血清封閉液購自北京康為世紀生物科技有限公司，鼠抗人Ephrin B2單克隆抗體、生物素標記的兔抗鼠IgG工作液由北京義翹神州科技有限公司 提供，Western blot中抗體購自英國Abcam公司，人肺腺癌A549細胞由美國菌種保藏中心(ATCC)提供。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學 取甲醛固定標本，石蠟包埋后切片并置于60℃溫箱烘1 h，使用二甲苯、梯度酒精、蒸餾水對切片進行處理。高原抗壓修復后PBS沖洗，加入10%正常山羊血清封閉液、鼠抗人Ephrin B2單克隆抗體、生物素標記的兔抗鼠IgG二抗工作液、鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液。PBS沖洗、DAB顯色、1%氨水返藍后使用梯度酒精脫水。各切片選擇5個高倍鏡視野，依據(jù)著色強度和陽性細胞比值判定免疫組化結果。結果判讀由專業(yè)病理科醫(yī)師采用雙盲法判定(重復實驗3次)。

1.2.2細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 將人A549細胞進行培養(yǎng)后選取第3代細胞分為4組：空白組(Blank組)，不轉(zhuǎn)染任何序列；陰性對照(NC組)；Ephrin B2 vector組，用脂質(zhì)粒體方法轉(zhuǎn)染Ephrin B2過表達質(zhì)粒；sh-Ephrin B2組，用脂質(zhì)粒體方法轉(zhuǎn)染含有Ephrin B2干擾片段的質(zhì)粒，將處于對數(shù)生長期的細胞置于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)然后使用250 μl 不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM對各組細胞稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)實驗。

1.2.3qRT-PCR實驗 提取轉(zhuǎn)染后各組A5490 NSCLC細胞中總RNA。使用Premier 5.0軟件進行qRT-PCR引物設計，并由Invitrogen設計合成Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin，Vimentin以及MMP-2引物，GAPDH做內(nèi)參照，引物序列見表1。使用PrimeScript RT試劑盒(RR036A，TaKaRa)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系10 μl，參照說明書進行以2 μg總RNA為模板，用GAPDH作為內(nèi)參引物采用相對定量法(2-ΔΔCt法)計算目的基因Ephrin B2、E-cadherin(上皮細胞標記蛋白)、N-cadherin，Vimentin(間質(zhì)細胞標記蛋白)、MMP-2 mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平：ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參)。實驗重復3次。

1.2.4Western blot實驗 提取各組細胞總蛋白并測定蛋白濃度，將分離蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，5% BSA室溫下封閉1 h。滴加一抗兔多抗Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2后于4℃過夜。PBS沖洗后孵育HRP 標記的兔抗人IgG抗體。室溫下膜與ECL液反應1 min。吸去液體，覆蓋保鮮膜，拍攝X光片。以GAPDH作內(nèi)參，以目標條帶與內(nèi)參照條帶的灰度值之比作為蛋白質(zhì)的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.5劃痕實驗 轉(zhuǎn)染48 h后收集各組A549 NSCLC細胞，以1×105/孔的密度接種于6孔板，借助無菌200 μl Tip頭在同等力度下在每個孔底部橫豎各劃4條痕，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入無血清培養(yǎng)液2 ml并且將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在劃痕后的第0、24小時后于倒置顯微鏡下拍照，各樣本均取5個視野細胞計數(shù)的平均值，對劃痕點寬度進行測量，計算各組劃痕愈合率，劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%，測量連續(xù)進行3次，依據(jù)結果評價各組細胞遷移能力。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequences

Target geneUpstream primer(5′-3′)Downstream primers(5′-3′)Ephrin B2ATGACAAGCTCTACCAGAGAGACCACATTAGTGGTGACTGTTGGAAE-cadherinCGAGAGCTACACGTTCACGGGGGTGTCGAGGGAAAAATAGGN-cadherinTTTGATGGAGGTCTCCTAACACCACGTTTAACACGTTGGAAATGTGVimentinGCCCTAGACGAACTGGGTCGGCTGCAACTGCCTAATGAGMMP-2AGATCTTCTTCTTCAAGGACCGGTTGGCTGGTCAGTGGCTTGGGGTAGAPDHAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCGCCCAATACGACCAAATC

Note：MMP-2.Mitochondrial membrane potentia；GAPDH.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2 結果

2.1NSCLC組織和癌旁正常組織中Ephrin B2蛋白表達陽性率 免疫組化檢測NSCLC患者的組織石蠟標本以及癌旁組織中的Ephrin B2蛋白表達情況顯示(圖1)，Ephrin B2在NSCLC組織和癌旁組織中均存在表達，胞核內(nèi)見到黃色顆粒為陽性細胞。肺癌組織和癌旁組織中呈現(xiàn)Ephrin B2蛋白高表達的共55例和7例，肺癌組織Ephrin B2蛋白陽性表達率顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)。對Ephrin B2蛋白表達情況與患者臨床參數(shù)之間的關聯(lián)進行分析發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2表達與患者性別、年齡、分期、病理類型及分級等參數(shù)沒有直接關系(P>0.05)，見表2。

2.2qRT-PCR檢測A549細胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達 qRT-PCR檢測A549細胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達結果顯示(圖2)： Blank組與NC組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Blank組相比，Ephrin B2 vector組Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達上升(P<0.05)，E-cadherin mRNA表達水平下降(P<0.05)。sh-Ephrin B2組Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達水平下降(P<0.05)，E-cadherin mRNA表達水平上升(P<0.05)。

2.3Western blot檢測A549細胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達 Western blot檢測A549細胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達結果顯示(圖3)： Blank組與NC組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Blank組相比，Ephrin B2 vector組Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達上升(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平下降(P<0.05)。sh-Ephrin B2組Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達水平下降(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平上升(P<0.05)。

圖1 Ephrin B2蛋白在NSCLC和正常組織中的表達(×200)Fig.1 Expression of Ephrin B2 protein in NSCLC tissues and normal tissues(×200)Note: Normal.Expression of Ephrin B2 protein in normal lung tissue(IHC score：1)；Tumor-L.Expression of Ephrin B2 protein in NSCLC tissues that was stained weakly positive(IHC score：2)；Tumor-H.Expression of Ephrin B2 protein in NSCLC tissues that was stained strongly positive(IHC score：16).

表2 Ephrin B2表達與NSCLC臨床特征的關系

Tab.2 Relationship between expression of Ephrin B2 and clinical features of NSCLC

FeaturesEphrin B2Low expressiongroupHigh expressiongroupχ2PSmokingNon smoker9110.0000.992Smoker3543Chronic cardiopulmonary diseaseYes24260.3970.529No2028Clinical stagesⅠ-Ⅱ26270.4580.499Ⅲ1926Metastasis(pN)Yes28300.6550.418No1624Pathological typeSquamous cell carcinoma28310.4420.802Adenocarcinoma1518Others24Organization classificationModerate and highdifferentiation28422.3760.123Poor differentiation1612

圖2 A549細胞中Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表達的差異Fig.2 mRNA expression of Ephrin B2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin in A549 cell linesNote: Compared with blank group，*.P<0.05.

圖3 A549細胞中Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達差異Fig.3 Protein expression of Ephrin B2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin in A549 cell linesNote: A.Protein expression profile;B.Protein expression of Ephrin B2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin in A549 cell lines.Compared with blank group，*.P<0.05.

圖4 各組細胞的遷移能力差異Fig.4 Differences of migration and invasionability in A549 cell linesNote: A.Cell scratch test′s result of A549 cell lines;B.Bar graphof cell migration experiment result in A549 and H520 cell lines.Compared with blank group,*.P<0.05.

2.4Ephrin B2與A549細胞的遷移作用關系 劃痕實驗結果顯示(圖4)：Blank組與NC組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Blank組比較，Ephrin B2 vector組NSCLC細胞遷移上升(P<0.05)；sh-Ephrin B2組NSCLC細胞遷移下降(P<0.05)。

3 討論

Eph(Erythropoietin producing hepatocellular carcinoma cell line)是當前已知的最大的受體型酪氨酸激酶家族，其在人體的病理和生理過程中均扮演著重要角色[6]。Ephrin(Eph family receptor interacting proteins)為Eph的配體，受體能夠和配體通過相互接觸而結合，被對方激活進而實現(xiàn)磷酸化和信號轉(zhuǎn)導[7]。Ephrin B2作為一種跨膜蛋白，近年來被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于鼻咽癌、肝癌以及乳腺癌等惡性腫瘤中[8-10]。

本研究利用免疫組化方法對NSCLC患者肺癌組織以及癌旁正常肺組織中Ephrin B2蛋白的陽性表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2蛋白在肺癌組織中的表達(56.12%)顯著高于其在癌旁正常肺組織中的表達(20.59%)，且差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)。分析Ephrin B2蛋白表達與患者臨床參數(shù)之間的關聯(lián)，二者之間不存在直接關系(P>0.05)。有研究在探討Ephrin B2蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達時發(fā)現(xiàn)Ephrin B2與腫瘤基因R-Ras存在關聯(lián)，Ephrin B2受體能夠激活Ras-MARK以及ATK信號途徑。該系統(tǒng)能夠?qū)毎至阉鼗罨鞍准っ竿愤M行調(diào)節(jié)，進而促進腫瘤細胞的生成，增強其侵襲性[11]。另外，關于Ephrin B2表達與子宮內(nèi)膜癌關系的研究顯示，Ephrin B2以及EphB4二者在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達均顯著升高，且二者存在相關性[12]。提示EphB4可能通過與Ephrin B2相結合并且激活Ephrin B2來實現(xiàn)促進子宮內(nèi)膜癌新生血管生成、促進其發(fā)生和轉(zhuǎn)移的目的。本研究觀察NSCLC組織中Ephrin B2的表達以及NSCLC組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移情況，肺癌組織中間質(zhì)標記蛋白以及促腫瘤轉(zhuǎn)移因子的蛋白和mRNA表達相對于癌旁組織顯著升高(P<0.05)。提示NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移能力更強。qRT-PCR篩選出肺腺癌和肺鱗癌A549和H520細胞系后，檢測Ephrin B2基因和NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)移相關標志性因子的mRNA和蛋白表達水平結果發(fā)現(xiàn)，與Blank組與NC組相比，Ephrin B2 vector組Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin和Fibronectin mRNA以及蛋白的表達均顯著上升(P<0.05)，而上皮標記蛋白的mRNA以及蛋白表達均顯著下降。進一步說明了Ephrin B2基因在促進NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。另外，Ephrin B2 vector組中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)移相關因子的表達顯著增強，提示Ephrin B2基因能夠促進NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)移。劃痕實驗進一步顯示，Ephrin B2上調(diào)在促進A549和H520 NSCLC細胞的遷移和侵襲中其重要作用。Kore等[13]在探究Ephrin B2表達與膠質(zhì)瘤的惡性程度的關系時發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2表達與腫瘤的惡性程度呈正相關。Ephrin B2表達對腫瘤的侵襲、惡性程度的增強起推動作用[14]。與本研究中結果一致。我們使用Hoechst33342/PI核熒光雙染對兩組細胞系細胞凋亡情況進行檢測發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2上調(diào)能夠促進A549和H520 NSCLC細胞的凋亡，這可能與隨著時間的延長，各組細胞缺乏營養(yǎng)存在一定關聯(lián)。而使用CCK-8法以及細胞平板克隆形成實驗對兩組細胞系的增殖和克隆情況進行檢測發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2上調(diào)能夠促進A549和H520 NSCLC細胞的增殖和克隆。進一步證實了Ephrin B2與腫瘤的生長、分化之間的關聯(lián)。

綜上所述，Ephrin B2在肺癌中高表達，Ephrin B2與NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移存在關聯(lián)，抑制Ephrin B2的表達，能夠抑制NSCLC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移。Ephrin B2有望成為治療肺癌治療新的靶點。