朱 琪，梁世岳，魯 森，趙 駿，李玉鵬，喬家運,2，李?；?/p>

(1.天津大學化工學院，天津 300350；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；3.天津大學理學院化學系，天津 300072； 4.天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 301617；5.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384)

仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌及其內(nèi)毒素引起的，給中國乃至世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失[1]。仔豬斷奶應(yīng)激由多種原因引起，其中大腸桿菌病繼發(fā)感染導致腹瀉是仔豬死亡的重要原因，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)人工感染大腸桿菌可以引起仔豬氧化損傷，并激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路[2]。飼料中添加女貞子可以提高斷奶仔豬生長性能，免疫功能和抗氧化能力[3]。女貞子多糖是女貞子的重要有效成分，具有促進仔豬生長、調(diào)節(jié)免疫、防病和抗氧化應(yīng)激等多重功效[4]。本研究通過在飼料中添加女貞子多糖飼喂斷奶仔豬，口服大腸桿菌K88攻毒后，檢測血清和肝腎組織中的氧化應(yīng)激相關(guān)因子，并評價肝臟組織MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的轉(zhuǎn)錄水平，來分析女貞子多糖抗仔豬感染大腸桿菌病的分子機制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及分組 選取體重接近(7.93±1.36)kg，(21±2)日齡，健康三元雜交斷奶仔豬“杜×長×大”20頭。

1.1.2 女貞子多糖的制備 根據(jù)水提醇沉法進行女貞子多糖的提取。取200 g炙女貞子于70 ℃烘箱中，3 h后將烘干的女貞子倒入粉碎機粉碎，過40目篩。稱40 g女貞子粉放于320 mL蒸餾水中在100 ℃中加熱回流2 h，用真空泵抽濾。把分離出的水溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫除水分濃縮，濃縮到3 g/mL時停止，此時加入一定量乙醇(約67 mL)，使乙醇體積分數(shù)占比達到70%，再用玻璃棒進行攪拌15 min后靜置6 h。最后真空泵抽濾析出沉淀，抽濾得到的濾餅為女貞子多糖，最后放于烘箱中烘干，稱重得4.1 g女貞子多糖，得糖率為10.25%[5]。用此方法共制得200 g女貞子多糖用于后續(xù)試驗，制備工作在天津大學理學院和天津中醫(yī)藥大學中藥學院共同完成。

1.1.3 試驗日糧及飼養(yǎng)管理 斷奶仔豬20頭，每頭仔豬為單籠飼養(yǎng)，隨機分為4組，每組5頭仔豬，標記為對照組、大腸桿菌組、女貞子多糖組和大腸桿菌+女貞子多糖組，。對照組和大腸桿菌組飼喂基礎(chǔ)飼糧，女貞子多糖組和大腸桿菌+女貞子多糖組飼喂基礎(chǔ)日糧中添加了0.1%的女貞子多糖的飼糧。試驗為期15 d，每頭仔豬為單籠飼養(yǎng)，自由飲水和采食，濕度為55%～70%，溫度為25～28 ℃。在試驗進行到第14天時斷料不斷水，大腸桿菌組和大腸桿菌+女貞子多糖組攻毒大腸桿菌。24 h后所有仔豬進行采血，分離血清進行檢測。隨后屠宰仔豬采取肝臟和腎臟，用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行沖洗，并迅速放到液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 仔豬大腸桿菌病模型的建立 在飼養(yǎng)第14天時，口服大腸桿菌K88菌液1 mL/kg(菌液濃度為2×109CFU/mL)，菌種為實驗室前期保存，具體操作方法參照文獻[5]，通過臨床診斷，血常規(guī)和血清生化指標作為仔豬大腸桿菌病的判定標準，在24 h內(nèi)記錄仔豬的發(fā)病情況，24 h后采血剖檢采樣。

1.2.2 血清及肝、腎氧化指標檢測 血清丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、和過氧化氫酶(CAT)都采用的是比色的方法進行測定，仔豬屠宰后剖檢，無菌采集肝臟和腎臟組織，2 h內(nèi)測定肝臟、腎臟的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，并嚴格按照試劑盒使用說明進行操作。

1.2.3 引物設(shè)計與合成 基因序列的引物是由上海生工工程(北京)技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成?；蛎Q及引物序列見表1。

表1 氧化應(yīng)激相關(guān)基因引物序列Tab 1 Oxidative stress related gene primer sequences

1.2.4 斷奶仔豬肝臟相關(guān)基因的檢測

綜合以上內(nèi)容，陶瓷與酒的結(jié)合在歷史上由來已久，對于現(xiàn)代酒類包裝設(shè)計工作的展開來說，設(shè)計人員必須能在確保陶瓷這一傳統(tǒng)文化元素發(fā)揮出自身作用的同時，保證酒類產(chǎn)品外包裝設(shè)計的創(chuàng)新性。

1.2.4.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 樣品處理：首先稱重研磨管并記錄，采取各組肝臟分別放于研磨管中，稱重記錄。RNA提取：使用DNA/RNA Extraction Kit(金瑞鴻捷生物科技有限公司)試劑盒進行提取。反轉(zhuǎn)錄：使用All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit(廣州易錦生物技術(shù)有限公司)試劑盒。

1.2.4.2 實時熒光定量PCR 使用All-in-OneTMqPCR Mix(廣州易錦生物技術(shù)有限公司)試劑盒，加樣、離心、振蕩、離心，然后把8連管放入到熒光定量PCR儀中。反應(yīng)程序為：預(yù)變性95 ℃，10 min；40個循環(huán)；溶解曲線分析。

1.3 統(tǒng)計分析 Excel2013對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理，采用SPSS20.0分析軟件進行單因素方差統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，以P<0.01作為差異極顯著判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 女貞子多糖對感染大腸桿菌仔豬血清抗氧化指標的影響 由表2可知，試驗Ⅰ組仔豬血清MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)，而超氧化物歧化酶(SOD)含量顯著低于對照組(P<0.05)。試驗Ⅰ組仔豬血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量與試驗Ⅲ組無顯著差異(P>0.05)，且試驗Ⅱ與試驗Ⅰ組亦無顯著差異(P>0.05)。對照組仔豬血清過氧化氫酶(CAT)含量顯著高于其余各組(P<0.05)，且其余各組間無顯著差異(P<0.05)。

2.2 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬肝、腎抗氧化指標的影響 由表3可知，肝臟MDA含量大腸桿菌組最高，和其它三組比較差異極顯著(P<0.01)，SOD含量大腸桿菌組最低，比對照降低了57.86%，差異極顯著(P<0.01)；腎臟MDA含量各組差異不顯著(P>0.05)，SOD含量大腸桿菌組比對照組下降了58.21%，差異極顯著(P<0.01)。

2.3 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達的影響 由表4可知，肝臟CAT基因轉(zhuǎn)錄水平：大腸桿菌組顯著高于對照組和大腸桿菌+女貞子多糖組(P<0.05)，與女貞子多糖組差異不顯著(P>0.05)；錳超氧化物歧化酶(MnSOD)和鋅銅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)各組變化趨勢基本一致；谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)：大腸桿菌組顯著高于其它各組(P<0.05)；谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)各組差異不顯著(P>0.05)。

表2 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響Tab 2 Effects of ligustrum polysaccharide on serum antioxidant indexes of weaned piglets

同行數(shù)據(jù)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

表3 女貞子多糖對斷奶仔豬感染大腸桿菌肝腎抗氧化能力的影響Tab 3 Effects of ligustrum polysaccharide on liver and kidney antioxidant capacity of weaned piglets infected with E.coli

同行數(shù)據(jù)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

表4 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬肝臟的氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達的影響Tab 4 Effects of ligustrum polysaccharide on mRNA expression of oxidative stress related genes in liver of weaned piglets infected with E.coli

同行數(shù)據(jù)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

2.4 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬炎癥介質(zhì)與細胞內(nèi)分子相關(guān)基因表達的影響 由表5可知，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)各組均高于對照組且差異極顯著(P<0.01)；熱休克蛋白70(HSP70)各組均高于對照組且差異極顯著(P<0.01)；環(huán)氧酶2(COX2)各組差異不顯著(P>0.05)。

表5 女貞子多糖對斷奶仔豬感染大腸桿菌炎癥介質(zhì)與細胞內(nèi)分子相關(guān)基因表達的影響Tab 5 Effects of ligustrum polysaccharide on the expression of intracellular molecule-related genes and inflammatory mediators of weaned piglets infected with E.coli

同行數(shù)據(jù)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

表6 女貞子多糖對感染大腸桿菌斷奶仔豬肝組織MAPK相關(guān)基因表達的影響Tab 6 Effects of ligustrum polysaccharide on MAPK-related gene expression in liver of weaned piglets infected with E.coli

同行數(shù)據(jù)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

3 討論與結(jié)論

3.1 女貞子多糖對大腸桿菌誘導斷奶仔豬氧化應(yīng)激的保護作用 大腸桿菌可以引起斷奶仔豬應(yīng)激，產(chǎn)生大量自由基，進而導致仔豬機體的氧化損傷[6]。通過一系列的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最終產(chǎn)生MDA，其含量的高低能夠間接反應(yīng)自由基產(chǎn)生的多少，也可以體現(xiàn)脂質(zhì)過氧化在畜禽機體組織細胞內(nèi)的反應(yīng)程度。SOD和GSH廣泛的存在動物機體的組織中，可以使超氧陰離子O2-轉(zhuǎn)化為H2O2進而被清除，它含量的高低能夠反映出動物機體清除自由基的能力[7]。動物機體內(nèi)的CAT是防御體系非常重要的酶，能夠?qū)⑦^氧化氫(H2O2)轉(zhuǎn)化為分子氧和水。

前期研究發(fā)現(xiàn)，女貞子萃取物可以有效降低仔豬血清和肌肉中的MDA含量，提高肝臟SOD和血清GSH-Px水平。植物多糖可以顯著提高斷奶仔豬血清總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性和總抗氧化能力，降低血清和組織中的MDA含量[8]。研究發(fā)現(xiàn)，女貞子多糖可以顯著降低由大腸桿菌引起的仔豬血清MDA含量的升高，對大腸桿菌引起的抗氧化酶下調(diào)有緩解作用，但對正常對照組仔豬無顯著影響，揭示出女貞子多糖對仔豬的調(diào)節(jié)保護作用。本課題組前期研究表明仔豬人工感染大腸桿菌后，血清生化指標顯示肝、腎功能異常，研究選取肝、腎組織兩個關(guān)鍵氧化指標MDA和SOD作為參數(shù)[7]。從結(jié)果來看女貞子多糖可以通過調(diào)節(jié)肝腎組織中MDA和SOD的水平，起到保護肝腎的目的，這與前期的研究相一致。

3.2 女貞子多糖對大腸桿菌仔豬肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和MAPK信號的調(diào)控 GPX1、GPX4是GSH-Px家族的同工酶，它能夠使細胞避免氧化攻擊、抵抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和清除動物機體內(nèi)的氧自由基。GPX4在機體內(nèi)對磷脂氫過氧化物有比較高的活性，與VE結(jié)合能夠起到抗氧化的作用，并且能夠還原磷脂，使動物機體的細胞避免脂質(zhì)過氧化。

研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬感染大腸桿菌后，肝臟GPX1基因轉(zhuǎn)錄水平有所升高，預(yù)示肝組織將產(chǎn)生更多的GSH-Px酶抵御氧化應(yīng)激。

CuZnSOD能夠?qū)⒊蹶庪x子的自由基轉(zhuǎn)移性清除，在維持動物機體內(nèi)的氧自由基相對平衡能夠起到十分重要的作用。在動物發(fā)生氧化應(yīng)激的時候MnSOD有著非常迅速的反應(yīng)性，以及它在細胞的線粒體中能夠?qū)⒊趸镛D(zhuǎn)化為氧分子和H2O2，進而把機體內(nèi)有害的ROS清除。與CAT相關(guān)的基因能夠調(diào)節(jié)機體內(nèi)過氧化氫酶的分泌與合成，CAT在機體內(nèi)能夠?qū)2O2轉(zhuǎn)化成水和分子氧，進而使H2O2得到清除，使機體免受過氧化的傷害。研究發(fā)現(xiàn)，當仔豬感染大腸桿菌后，女貞子多糖可以提高仔豬肝臟中CAT和CuZnSOD轉(zhuǎn)錄水平，從而清除體內(nèi)過量的氧自由基。

COX2和TNF-α是動物體內(nèi)非常重要的急性炎癥因子，正常情況下表達量很少或者不表達，機體在發(fā)生炎癥后，COX2和TNF-α的表達量會大幅增加。HSP在細胞內(nèi)能夠起到保護作用，在動物機體細胞當中能夠找到高效的HSP70，它能夠緩解機體發(fā)生的炎癥反應(yīng)，并且對肝臟的再生起到促進作用。有研究證實，動物機體細胞內(nèi)的HSP70能夠與NF-κB相互反應(yīng)，避免NF-κB在動物機體內(nèi)活化[9]。實驗表明仔豬感染大腸桿菌后，肝臟COX2基因表達量相對不變，而TNF-α的表達量極顯著升高；女貞子多糖前處理后，TNF-α的表達量變化不顯著，但攻毒大腸桿菌后TNF-α的表達量極顯著降低。這說明在正常情況下，女貞子多糖對仔豬肝臟TNF-α的轉(zhuǎn)錄表達無影響，但可以降低大腸桿菌攻毒后的轉(zhuǎn)錄表達，提示女貞子多糖對肝組織的保護機理與抑制急性炎癥因子相關(guān)。

MAPK是一種絲氨酸蛋白激酶或者是一種蘇氨酸蛋白激酶，能夠感受上游受體傳來的信號，并且能夠?qū)⑿盘杺鲗У较鄳?yīng)的細胞核當中，能夠調(diào)節(jié)基因的表達以及細胞的增殖和凋亡。MAPK由三種重要的蛋白激酶組成,ERK對細胞能夠起到保護的作用，而P38和JNK對細胞起到促進凋亡的作用[10]。MAPK信號通路當中Ras/Raf/MEK/ERK信號通路是一條比較成熟的通路，它能夠?qū)⒓毎さ氖荏w所接受信號轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，進而細胞內(nèi)相應(yīng)蛋白得到了表達，它可以調(diào)節(jié)細胞的自噬、凋亡、分化和增殖等重要功能[11-12]。研究表明抑制ERK信號通路之后，可以緩解氧化損傷對細胞的損害，與之相反，激活ERK信號通路能夠?qū)毎鸬綋p傷的作用。本試驗通過研究發(fā)現(xiàn)仔豬肝臟mRNA轉(zhuǎn)錄水平ERK1的大腸桿菌+女貞子多糖組與大腸桿菌組相比降低且差異極顯著，而女貞子多糖組與對照組相比差異不顯著，說明女貞子多糖對斷奶仔豬感染大腸桿菌起到了保護作用，且對正常仔豬沒有不良影響，但P38和JNK基因表達相對較低，與上述研究一致。

3.3 結(jié)論 女貞子多糖可以通過調(diào)節(jié)肝臟抗氧化指標保護大腸桿菌引起的仔豬氧化應(yīng)激反應(yīng)，其作用機制可能與下調(diào)MAPK相關(guān)信號轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)，從而揭示女貞子保護仔豬肝臟的分子機理。