張明亮，周玲玲，連凱琪*，周孝蕊，宋玉偉，王雙山

(1.安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽 455000；2.河南省動物疫病防控與營養(yǎng)免疫院士工作站，河南安陽 455000； 3.河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國際聯(lián)合實驗室，河南安陽 455000)

豬大腸桿菌病是豬群常見傳染病，其病原為致病性大腸桿菌，主要引發(fā)豬敗血癥、仔豬黃痢、仔豬白痢等癥狀[1-2]。大腸桿菌血清型種類復(fù)雜，給疫苗的研制和制備帶來了很多的困難，目前治療大腸桿菌病仍然以抗菌藥物為主。但近年來隨著各種抗生素的濫用，細(xì)菌的耐藥率持續(xù)上升，多重耐藥問題更加嚴(yán)重，給大腸桿菌的治療帶來困難，在增加治療成本的同時也給人類食品安全留下隱患。對豬源大腸桿菌基本耐藥情況的研究，有助于預(yù)防和治療此菌引起的疾病，同時對維護公共衛(wèi)生安全也有著重要的意義[3]。本研究得到了21株豬源大腸桿菌，分析菌株的耐藥情況，檢測其耐藥基因分布，同時對病原菌進行了RAPD分析，以期為該地區(qū)豬源大腸桿菌病的防治提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 實驗菌株 從河南安陽、新鄉(xiāng)、焦作等地區(qū)的規(guī)?；i場采集21株(菌株1、3、6、7、8、10、11、21分離自安陽滑縣、內(nèi)黃、安陽縣規(guī)?；B(yǎng)殖場；菌株9、14、15、16、20分離自新鄉(xiāng)輝縣市、衛(wèi)輝市、長垣縣規(guī)?；B(yǎng)殖場；菌株2、4、5、12、13、17、18、19分離自焦作市馬村區(qū)、修武縣、孟州市規(guī)?；B(yǎng)殖場)疑似大腸桿菌病死豬的肝臟、分泌物等。采用細(xì)菌學(xué)、PCR試驗等方法鑒定為豬源致病性大腸桿菌。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試劑 LB瓊脂、麥康凱瓊脂、LB液體培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自杭州濱河微生物試劑有限公司。Premix Taq，DL2000 DNA Marker 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 參照相關(guān)文獻[4-5]及GeneBank設(shè)計出9種擴增常見抗生素基因和RAPD多態(tài)性分析所用的引物(表1)。

2 方 法

2.1 藥敏試驗 本實驗采用紙片擴散法(K-B法)[6]。測定大腸桿菌對四環(huán)素、紅霉素、頭孢拉定、麥迪霉素、阿莫西林、磺胺異惡唑、環(huán)丙沙星、新生霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、甲氧芐啶、慶大霉素、洛美沙星、阿米卡星、頭孢氨芐、頭孢曲松鈉等16種常用抗生素的敏感性。采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控大腸桿菌ATCC25922菌株作為對照組。結(jié)果參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI2017版)腸桿菌科細(xì)菌抑菌圈直徑標(biāo)準(zhǔn)，來判定分離株對各種抗生素的敏感情況[7-8]。

挑取分離培養(yǎng)的單個典型菌落在MH肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，取適量菌液均勻地涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基表面，用無菌鑷子夾取常用抗生素的藥敏紙片，分別貼到瓊脂平板表面，先將平板中央放一張藥敏片，周圍分布均勻放四張，37 ℃培養(yǎng)。用毫米刻度尺測量抑菌圈的大小，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果進行對比。參考標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 PCR擴增耐藥基因引物的序列Tab 1 primer sequence for PCR amplification of drug-resistant gene

RAPD多態(tài)性分析所用的引物序列為：AGCGGGCCAA;以上引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表2 抗生素的抑菌圈直徑與敏感度參考標(biāo)準(zhǔn)Tab 2 Antibiotic Bacteriostasis Circle Diameter and Sensitivity reference standard

2.2 模板DNA的制備 利用煮沸法提取細(xì)菌的基因組DNA。取過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液600 μL，10000 r/min離心2min，棄上清，加300 μL ddH2O，以相同的轉(zhuǎn)速離心后棄上清，再加150 μL ddH2O，沸水煮10 min，離心取上清，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大腸桿菌基因PCR的擴增 耐藥基因擴增體系20 μL：Premix Taq 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O補平至20 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s，不同退火溫度(溫度見表1)，72 ℃ 45 s，34個循環(huán)；終末延伸72 ℃ 10 min。對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2.4 基因多態(tài)性分析的PCR擴增 隨機引物擴增體系25 μL：Premix Taq 12.5 μL，引物1 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O補平至25 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，36 ℃ 5 min，72 ℃ 5 min，4個循環(huán)；95 ℃ 1 min，36 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)，終末延伸72 ℃ 10 min。對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

3 結(jié)果與分析

3.1 分離株藥敏試驗 對分離的陰性致病性大腸桿菌菌株進行藥敏試驗，結(jié)果表明21株大腸桿菌對四環(huán)素、紅霉素、麥迪霉素、阿莫西林、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、新生霉素、甲氧芐啶耐藥率為100%；對慶大霉素、洛美沙星耐藥率為80%以上；阿米卡星、頭孢氨芐、頭孢曲松鈉、頭孢拉定在40%～70%。其中，對氨基糖苷類敏感的菌株為菌株1、6、8、9、11、16、20；對β-內(nèi)酰胺類敏感的菌株為菌株1、2、5、12、13、15、18、19；對喹諾酮類敏感的菌株為菌株10、19(表3)。

表3 大腸桿菌菌株對抗生素的敏感性試驗Tab 3 Antimicrobial susceptibility test of Escherichia coli against antimicrobial drugs

3.2 分離株耐藥基因的PCR擴增 對分離鑒定的21株豬源致病性大腸桿菌進行了四環(huán)素類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、磺胺類9種耐藥基因的擴增。其中TetA、TetB、BlaTEM-1耐藥基因的菌株數(shù)檢出率為100%；Sul3耐藥基因的菌株檢出率為85.71%；Aph(3’)-Ⅱa耐藥基因的菌株檢出率為76.19%；AadA1耐藥基因的菌株檢出率為57.14%；Sul1耐藥基因的菌株檢出率為38.09%；Cat1耐藥基因的菌株檢出率為19.04%；而TetC耐藥基因未被檢測到(表4)。

3.3 多態(tài)性分析的PCR擴增 對分離鑒定的21株大腸桿菌(圖1)進行限制性片段多態(tài)性分析。根據(jù)指紋圖譜的條帶數(shù)目和位置，可以將21株分離株分為7個基因型。2、7、9命名為Ⅰ型，占14.3%；3、21命名為Ⅱ型，占9.5%；4、5命名為Ⅲ型占9.5%；6、11、12命名為Ⅳ型，占14.3%，占9.5%；8、22命名為V型，占9.5%；10、13、18、19、20命名為VI型，占23.8%；14、15、16、17命名為VII型，占19%。

表4 分離株耐藥基因檢測結(jié)果Tab 4 Detection results of drug resistance genes in isolates

M：DL2000 Marker；1：水對照；2-22：分離株分析結(jié)果M: DNA Marker Ladder (DL 2000); 1: Water Control; 2-22: Analysis results of isolates圖1 分離菌株RAPD多態(tài)性分析電泳圖譜Fig 1 RAPD polymorphism analysis of isolated strains

4 討論與結(jié)論

大腸桿菌是腸桿菌科的重要成員，能引起動物的大腸桿菌病。近些年，抗生素的濫用或不合理運用，使大腸桿菌耐藥基因不斷出現(xiàn)。從最初的單一耐藥，耐藥率低，傳播速度緩慢，到如今變?yōu)槟退幾V寬，耐藥率高，耐藥性傳播速度快的局面[2]。本研究對豫北地區(qū)分離的大腸桿菌菌株進行了藥敏實驗，結(jié)果表明分離株對四環(huán)素、紅霉素、麥迪霉素、阿莫西林、磺胺異惡唑、環(huán)丙沙星、新生霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、甲氧芐啶的耐藥程度較高,耐藥率均為100%，這一結(jié)果與艾偉昌等[3]報道的河南省豬源大腸桿菌對四環(huán)素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明的耐藥率分別為97.7%、97.7%、90.6%結(jié)果相近，提示該地區(qū)臨床應(yīng)禁用這些藥物，加強這些藥物在該地區(qū)的使用監(jiān)管。同時，對于恩諾沙星的耐藥率，本研究顯著高于艾偉昌等[3]的報道，這表明大腸桿菌的耐藥機制可能與同一地區(qū)的飼養(yǎng)管理條件及抗生素使用種類存在廣泛的聯(lián)系。同時發(fā)現(xiàn)分離自安陽各縣的菌株對氨基糖苷類抗生素較為敏感，分離自焦作各區(qū)縣的菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素較為敏感，這為相應(yīng)地區(qū)防治豬源大腸桿菌臨床用藥提供了參考。菌株的多重耐藥也是近年來抗生素難以奏效的重要因素。有報道指出，河南省規(guī)?；i場大腸桿菌耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重，耐藥譜較廣，并且呈現(xiàn)不同程度的多重耐藥，每種菌株至少對3種抗生素耐藥[9]。本研究結(jié)果與該報道一致。本研究表明多重耐藥在分離株中普遍存在。這可能是由于細(xì)菌處于相同的藥物選擇壓力下，導(dǎo)致相似耐藥譜型的出現(xiàn)[10]。建議臨床中合理用藥，同時采取多種用藥方式以減輕對大腸桿菌的選擇性壓力，降低細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的概率[11]。

四環(huán)素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類等抗生素是臨床防治大腸桿菌的首選藥物。多年的濫用或不合理運用使大腸桿菌耐藥基因不斷出現(xiàn)。本研究對分離出的21株大腸桿菌進行了9種耐藥基因的檢測，結(jié)果表明四環(huán)素類TetA、TetB均為100%；氨基糖苷類AadA1、Aph(3’)-Ⅱa分別為57.14%、76.19%；β-內(nèi)酰胺類BlaTEM-1為100%；氯霉素類Cat1為19.04%；磺胺類Sul1、Sul3分別為38.09%、85.71%。其中四環(huán)素類耐藥基因TetB檢測率高于張炳亮等[12]的報道；與王學(xué)君等[13]報道的四環(huán)素類耐藥基因TetA檢出率相當(dāng)，這表明四環(huán)素耐藥基因TetA可能成全國性分布，這與該類抗生素的不合理運用有關(guān)。同時，顏友榮[14]等的報道表明四環(huán)素類TetC耐藥基因檢出率為43.20%，而本研究并未檢出該基因的存在，表明不同地區(qū)介導(dǎo)同一耐藥性的耐藥基因可能存在差異。氨基糖苷類耐藥基因Aph(3’)-Ⅱa是常見的耐藥基因之一，本研究檢出率高于張炳亮等[12]的報道，低于晏云濤等[2]的報道，這可能與不同地區(qū)豬的年齡、性別和品種相關(guān)。

磺胺類藥物具有與對氨苯甲酸相類似的分子結(jié)構(gòu)，二者競爭性抑制二氫葉酸合成酶的活性，從而抑制細(xì)菌的生長與繁殖。Sul1基因在不同臨床和環(huán)境分離菌株中存在，具有攜帶和傳播磺胺抗性的作用[15-16]。Sul1和Sul3是已知的質(zhì)粒編碼的磺胺耐藥基因，可產(chǎn)生二氫葉酸合成酶并誘導(dǎo)磺胺類藥物的抗性[17], 二氫葉酸還原酶利用NADPH 還原二氫葉酸產(chǎn)生四氫葉酸，從而影響細(xì)菌核蛋白合成。細(xì)菌的耐藥機制是十分復(fù)雜的。發(fā)現(xiàn)分離菌株對磺胺類完全不敏感，而磺胺類耐藥基因Sul1和Sul3檢出率分別為38.09%和85.71%，這可能是因為分離菌株含有其他耐藥基因或存在其他耐藥機制。本研究發(fā)現(xiàn)Sul3檢出率較高，提示該基因可能是介導(dǎo)本地區(qū)豬源大腸埃希菌對磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要基因型。氯霉素類藥物是一種廣譜抗生素，吸收快、體內(nèi)分布廣泛，在獸醫(yī)臨床上發(fā)揮著重要的作用，特別對大腸桿菌和沙門菌等革蘭陰性菌有較強的抑菌作用[18]。氟苯尼考因其安全性和有效性在我國獸醫(yī)臨床上被廣泛使用，是目前獸醫(yī)臨床主要應(yīng)用的氯霉素類抗生素。本研究在分離株中檢測到了氯霉素類耐藥基因，表明該地區(qū)已出現(xiàn)耐藥菌株，應(yīng)做好該類抗生素的合理應(yīng)用，避免耐藥性跨種傳播。耐藥基因的檢測有助于了解該地區(qū)流行株耐藥基因存在的種類、數(shù)量及流行規(guī)律，從而豐富和完善豬源致病性大腸桿菌耐藥性的分子流行病學(xué)資料，而目前國內(nèi)外尚未見商品化的相關(guān)耐藥基因檢測試劑盒，這為研制PCR試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

隨機擴增DNA多態(tài)性擴增(RAPD)技術(shù)曾被用于確定微生物感染的暴發(fā)流行、傳染源及其遺傳相差型等研究[19-20]。RAPD圖譜具有較大相似性的菌株之間應(yīng)該屬于同一類群，反之則為不同的類群，因此，可以通過RAPD分型的方法來檢測菌株之間同源性的高低。本研究的分型中，共得到7種不同的基因型，顯示出該地區(qū)致病性大腸桿菌基因型的復(fù)雜性。同時，發(fā)現(xiàn)同一基因型的不同菌株對抗生素的敏感性存在較大差異，表明該地區(qū)大腸桿菌在抗生素選擇壓力下，其耐藥性更加的復(fù)雜化。

本研究對豫北地區(qū)豬源致病性大腸桿菌的耐藥性、耐藥基因及分子分型做了研究，為全面了解豫北地區(qū)豬源致病性大腸桿菌的流行病學(xué)提供了參考數(shù)據(jù)，同時為該地區(qū)豬源大腸桿菌病臨床針對性合理用藥提供了實驗依據(jù)。