魏春霞，孫 淼，趙 煒，陳延飛，劉懷東，張 敏，李 嶺，陳 建，才學(xué)鵬*，曾巧英*，薛青紅*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730070；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081 )

伴隨我國居民生活水平的提高及膳食結(jié)構(gòu)的變化，牛肉、牛奶等產(chǎn)品市場需求旺盛，進而促進了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。牛布魯氏菌病、結(jié)核、炭疽、口蹄疫、病毒性腹瀉黏膜病、副流感、傳染性鼻氣管炎這幾種牛病常發(fā)病，威脅著這一產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，為了滿足民眾日常需求，減少養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟損失，建立一種快速高效檢測這幾種牛病原的方法用以這些疾病的預(yù)防和防控十分必要。

牛布魯氏菌(Brucella, Bru)、結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)、炭疽桿菌(Anthrax)、口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus, FMDV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhoea virus, BVDV)、牛副流感病毒3型(Bovine para￣influenza virus, BPIV3)、牛傳染性支氣管炎病毒(Bovine infectious rhinotacheitus virus, IBRV)均易感牛，在不同程度上均可造成牛消瘦、母牛流產(chǎn)，甚至導(dǎo)致死亡。目前，常用的布病檢測方法有琥紅平板實驗、凝集試驗及補體結(jié)合試驗；炭疽的檢測方法主要依賴微生物學(xué)及血清學(xué)方法，包括Ascoli氏反應(yīng)和PCR；結(jié)核的檢測常用過敏反應(yīng)等來鑒定；FMDV、BVDV、BPIV3、IBRV的檢測主要以病原分離、血清學(xué)試驗和分子生物學(xué)檢測方法為主。上述檢測方法均存在檢測指標(biāo)單一、操作復(fù)雜、費時費力等問題[1]，給牛群疫病診斷帶來一定困難。本文針對牛群主要發(fā)生疫病病原診斷方法存在的問題擬研究建立一種可以快速高效同時檢測七種牛疫病病原的基因芯片檢測技術(shù)，用于牛群疫病診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗所用檢測病原牛布魯氏菌疫苗、結(jié)核分支桿菌疫苗、炭疽芽孢桿菌弱毒苗、牛病毒性腹瀉病毒、牛副流感病毒、牛傳染性支氣管炎病毒、牛流行性熱病毒由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(IVDC)保存并提供，口蹄疫病毒疫苗由金宇保靈生物有限生物有限公司提供。所用臨床樣本采集自某養(yǎng)殖場，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。實驗用病原信息見表1。

表1 病原信息Tab 1 Pathogens information

1.1.1 主要試劑 核酸提取試劑盒AXYGEN Axyprep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-Script One Step RT-PCR Kit Ver2(TaKaRa)，PMD 18-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)，TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，MakerII(康為世紀(jì))，2×Taq MasterMix、普通質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，SA-HRP(Jackson)，PierceTM1-Step Ultra TMB Biotting Solution (Thermo)。

1.2 方法的建立

1.2.1 引物探針的設(shè)計 以布魯氏菌的外膜蛋白(OMP25)保守序列為靶基因設(shè)計引物；以炭疽芽孢桿菌的POX1質(zhì)粒和16SrDNA基因片段為模板設(shè)計引物探針；參照文獻[2]設(shè)計牛結(jié)核分枝桿菌引物及探針;副流感病毒N蛋白常作為分子診斷的靶基因,針對N基因設(shè)計引物及探針[3];IBRV有四類糖蛋白，針對gB蛋白基因的保守區(qū)域設(shè)計引物探針[4]；BVDV E2基因是病毒的主要保護性抗原編碼基因，在E2基因的5'端是不同毒株的主要變異區(qū)域,故選擇BVDV 5'-非翻譯區(qū)(5'-Untranslated region, 5'-UTR)設(shè)計引物和探針[5]；比較FMDV全基因組進行多序列比較，發(fā)現(xiàn)FMDV 7個血清型的保守基因是3D基因，進而根據(jù)該保守序列設(shè)計引物及探針。以上引物設(shè)計及性能評價用oligo7軟件。引物探針具體信息見表2和表3。

1.2.2 芯片的制備 探針用磷酸緩沖液稀釋至終濃度為6 μmol/L，設(shè)置點樣儀參數(shù)為100 drop，按照點樣順序?qū)⒏魈结橖c樣于納米膜上。點樣后將膜基片置于濕度為40%～60%，溫度為22～25 ℃條件下過夜晾干，2～8 ℃存放。芯片點樣模式見圖1。

表2 引物信息Tab 2 Primers information

表3 探針信息Tab 3 Probes information

Biotin、IC-1、IC-2為陽性質(zhì)控點，Buffer為陰性質(zhì)控點圖1 芯片點樣模式Fig 1 The chip spotting model

1.2.3 單一病原核酸的提取、擴增 參照核酸提取試劑盒說明書提取各病原的核酸，優(yōu)化退火溫度等PCR反應(yīng)條件。將BPIV3、BVDV、FMDV核酸(遺傳物質(zhì)為RNA)，Brucella、IBRV、MTB、Anthrax核酸(遺傳物質(zhì)為DNA)分別按常規(guī)體系擴增。反應(yīng)條件分別為50 ℃ 30 min，94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min；94℃ 5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。

1.2.4 混合樣品核酸的擴增 應(yīng)用多重PCR方法對混合樣品核酸進行擴增，通過對其退火溫度、引物用量等反應(yīng)條件優(yōu)化后，將樣品核酸按表4體系進行擴增。擴增條件為50 ℃ 30 min，94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 1 min，72℃ 30 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。

表4 混合樣品核酸擴增體系Tab 4 Mixed sample nucleic acid amplification system

1.2.5 基因芯片的雜交、洗滌與可視化檢測 取20 μL PCR產(chǎn)物，加入到100 μL的雜交液中，沸水浴5 min后加入到已47 ℃預(yù)熱芯片中,200 r/min 反應(yīng)20 min。棄去反應(yīng)液后用47 ℃預(yù)熱的洗滌液，200 μL/孔淋洗三遍,47 ℃孔板孵育器洗10 min。雜交液1∶2000稀釋SA-HRP，100 μL/孔，200 r/min，室溫反應(yīng) 10 min。洗滌液室溫淋洗2次，每孔加入60 μL TMB避光顯色。拍照記錄實驗結(jié)果。

1.2.6 結(jié)果判定 陰性質(zhì)控點不顯色，陽性質(zhì)控點的顏色為明顯強于陰性質(zhì)控點的藍紫色，兩個陽性質(zhì)控點至少有一個顯色為有效實驗結(jié)果。如被測樣品所在探針點不顯色，即為陰性；如果被測樣品所在探針點為藍紫色，則為陽性。

1.2.7 引物的特異性試驗 將各病原樣品擴增后，2%瓊脂糖凝膠電泳。將膠回收產(chǎn)物送往華大基因公司測序。

1.2.8 探針的特異性試驗 將七種病原、健康牛血清、牛流行性熱病毒，分別按照1.2.4擴增后進行芯片檢測。

1.2.9 芯片的靈敏度試驗 各病原PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳之后，將膠回收產(chǎn)物連接pMD 18-T Vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP 10感受肽細(xì)胞中，涂板，選取大小適中的單個菌落培養(yǎng)，菌液PCR后，將PCR陽性的菌液送往測序公司測序。使用DNA Star和NCBI Blast分析測序結(jié)果，同時將測序成功的陽性菌液擴增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。將各陽性質(zhì)粒定量后10倍倍比稀釋，擴增后分別與芯片反應(yīng),進行單一陽性質(zhì)粒靈敏度檢測同時對其進行2%瓊脂糖凝膠電泳。再將七種病原質(zhì)粒等濃度體積混合，10倍倍比稀釋，擴增后與芯片雜交,進行七種陽性質(zhì)?；旌响`敏度測定。

1.2.10 芯片的保存期試驗 將濃度為1.4×10-4ng/μL的七種病原陽性混合質(zhì)粒按照步驟1.2.4擴增，與在2～8 ℃保存30 d、60 d、120 d、180 d的芯片分別進行反應(yīng)。

1.2.11 芯片的重復(fù)性檢測 將同一質(zhì)控樣品的擴增產(chǎn)物用不同批次及同一批次內(nèi)不同芯片進行檢測。

1.2.12 芯片檢測臨床樣品與國標(biāo)方法檢測的比對

將23份牛血清、4份牛肺組織、3份牛腸組織臨床樣品提取核酸后，按照1.2.4方法進行擴增，擴增產(chǎn)物與芯片反應(yīng)后記錄檢測結(jié)果，芯片反應(yīng)操作同1.2.5。同時將各臨床樣本參照《奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)NY/T 1467-2007》、《動物炭疽診斷技術(shù)NY/T 561-2015》、《結(jié)核病病原菌實時熒光PCR檢測方法GB/T 27639-2011》、《口蹄疫檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T 1181-2010》、《牛病毒性腹瀉/粘膜病檢疫規(guī)范 SN/T 1129-2007》、《牛傳染性鼻氣管炎檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T 1164.1-2011》及中和試驗進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的特異性評價 各病原擴增產(chǎn)物大小與前期設(shè)計一致(圖2)，測序結(jié)果與設(shè)計目的片段相同。

M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: 結(jié)核桿菌; 2: 牛副流感病毒3型; 3: 牛病毒性腹瀉病毒; 4: 炭疽-16SrDNA; 5: 炭疽-POX1; 6,7: 牛傳染性鼻氣管炎病毒; 8-11: 口蹄疫病毒; 12-15：布魯氏菌M: MakerII; 1: MTB; 2: BPIV3; 3: BVDV; 4: Anthrax-16SrDNA; 5: Anthrax-POX1;6,7: IBRV; 8-11: FMDV; 12-15: Brucella圖2 PCR產(chǎn)物示意圖Fig 2 Schematic diagram of PCR product

2.2 探針的特異性評價 陰性質(zhì)控點無響應(yīng)，陽性質(zhì)控點響應(yīng)，各病原探針點特異性響應(yīng)。健康牛血清、牛流行性熱病毒除陽性質(zhì)控點響應(yīng)外，其他探針均無響應(yīng)(圖3)，表明所設(shè)計探針特異性良好。

1: 牛副流感病毒3型; 2: 牛病毒性腹瀉病病毒; 3: 口蹄疫病毒; 4: 傳染性鼻氣管炎病毒; 5: 炭疽-POX1; 6: 炭疽-16SrDNA; 7: 布魯氏菌; 8: 結(jié)核桿菌; 9: 健康牛血清; 10: 牛流行性熱病毒 1: BPIV3; 2: BVDV; 3: FMDV; 4: IBRV; 5: Anthrax-POX1; 6: Anthrax-16SrDNA; 7: Brucella; 8: MTB; 9: Healthy bovine serum; 10: Bovine epizotic fever virus圖3 探針特異性響應(yīng)實驗結(jié)果Fig 3 Probe specificity test results

2.3 芯片的靈敏度評價

2.3.1 單一陽性質(zhì)粒靈敏度 單一陽性質(zhì)粒芯片檢測靈敏度可達1.0 ×10-6ng/μL，比普通PCR高出10～100倍(表5)。

2.3.2 混合陽性質(zhì)粒靈敏度 當(dāng)混合陽性質(zhì)粒稀釋至濃度為1.4×10-5ng/μL時，各病原探針點與陽性質(zhì)控點均顯色，陰性質(zhì)控點無顯色。濃度為1.4×10-6ng/μL時，陽性質(zhì)控點正常顯色，陰性質(zhì)控點無顯色，病原探針點只有MTB、Anthrax有響應(yīng)(圖4)。故七種病原混合陽性質(zhì)粒芯片檢測靈敏可達1.4×10-5ng/μL。

2.4 芯片的保存期評價 同一擴增產(chǎn)物與2～8 ℃保存了30 d、60 d、120 d、180 d的芯片反應(yīng)后，陽性質(zhì)控點及七種病原對應(yīng)探針點均有顯色(圖5)，表明在2～8 ℃，芯片至少可保存180 d。

表5 單一病原質(zhì)粒檢測靈敏度Tab 5 Sensitivity of the single pathogen plasmid ng/μL

1: 1.4×10-1 ng/μL; 2: 1.4×10-2 ng/μL; 3: 1.4×10-3 ng/μL; 4: 1.4×10-4 ng/μL; 5: 1.4×10-5 ng/μL; 6: 1.4×10-6 ng/μL; 7: 1.4×10-7 ng/μL; 8: Blank control圖4 混合樣品靈敏度檢測結(jié)果Fig 4 Mixed sample sensitivity experiment results

1: 30 days; 2: 60 days; 3: 120 days; 4:180 days圖5 不同保存期實驗結(jié)果Fig 5 The results of different storage experiment

2.5 芯片的重復(fù)性評價 用同一批樣品的擴增產(chǎn)物與同一批次及不同批次的芯片進行反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，針對同一樣品，同一批次及不同批次的芯片的檢測結(jié)果均相同。芯片的可重復(fù)性為100%。

2.6 臨床樣本的檢測 30份牛樣品經(jīng)芯片檢測，其中Brucella檢出1份，BPIV3檢出7份，BVDV檢出10份，IBRV檢出11份，Anthrax、MTB、FMDV未檢出。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測Brucella檢出1份，BPIV3檢出7份，BVDV檢出12份，IBRV檢出10份，Anthrax、MTB、FMDV未檢出。其中單一病原感染占63.3%，兩種病原混合感染比例為36.7%。兩種檢測方法符合率為98.6%。具體數(shù)據(jù)見表6。

表6 臨床樣品檢測結(jié)果Tab 6 Results of clinical samples

+：陽性；-：陰性

3 討論與結(jié)論

基因芯片技術(shù)近些年來被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并在基因功能表達、致病機理、臨床診斷、藥物開發(fā)等研究方面取得突出成效[6]。目前針對這七種牛群常發(fā)病病原，國內(nèi)檢測方法一般為病毒分離試驗、血清中和試驗等方法。此類傳統(tǒng)方法都需要耗費較多的人力和時間，每次只能檢測一種病原。本實驗所研制的基因芯片檢測方法具有操作簡單，快速、便捷、高通量等特點。

基因芯片檢測技術(shù)一般包括芯片的制備，樣品的制備，樣品與芯片的生物反應(yīng)以及反應(yīng)信號的檢測與分析等[7]。本研究建立的基因芯片方法以“0+X”納米膜為支撐，與通常醛基化玻片為支撐的芯片檢測方法相比可大大縮短雜交、洗滌、顯色等芯片反應(yīng)各步驟的時間,本檢測方法僅需3 h，而采用醛基化玻片的芯片則需要至少5 h[8-10]。在樣品制備方面，根據(jù)各病原的特異性保守區(qū)域設(shè)計探針引物。據(jù)文獻可知探針大小及靶DNA的長度等因素會影響雜交信號[11]，本實驗各探針長度均在25 bp左右，各靶基因的目標(biāo)片段均在80～150 bp，保證了響應(yīng)信號的穩(wěn)定清晰。生物素與鏈霉親和素有良好的親和性[12]，用5'端標(biāo)記生物素的引物來擴增目的片段，探針與帶有生物素的擴增產(chǎn)物結(jié)合后再與HRP標(biāo)記的鏈霉親和素反應(yīng)，最后在底物顯色液的作用下，探針點可顯現(xiàn)出肉眼可見的藍紫色響應(yīng)點。方便肉眼觀察，且不需要復(fù)雜儀器來記錄實驗結(jié)果。同時該方法在點樣時設(shè)置了三個陽性質(zhì)控點及1個陰性質(zhì)控點，用以監(jiān)測操作過程的各步驟是否有效，保證檢測結(jié)果可靠性。

利用多重PCR擴增特異性片段，引物濃度及引物間相互作用會影響擴增效率[13]。將七種病原的八對引物排列組合后進行雙重PCR，發(fā)現(xiàn)本實驗中設(shè)計的炭疽的兩對引物和口蹄疫的引物對其他五種病原的擴增效率影響較大，但對他們自身擴增沒有影響，故將這兩種病原分開進行擴增，同時對各引物的最佳濃度進行優(yōu)化，建立完整的擴增體系。芯片反應(yīng)溫度對芯片檢測結(jié)果有一定影響，優(yōu)化芯片反應(yīng)溫度可得47 ℃為最佳芯片反應(yīng)溫度。對陽性質(zhì)控質(zhì)粒的濃度進行優(yōu)化，使其在檢測樣品不同濃度下可一直響應(yīng)，同時不影響樣品擴增的靈敏度。最終確定其濃度為1.0×10-3ng/μL時為最佳用量。

在確定的最優(yōu)條件下，該基因芯片單一病原檢測靈敏度可達1.0×10-6ng/μL，比普通PCR檢測方法靈敏10～100倍，對七種混合病原的檢測靈敏度達到1.4×10-5ng/μL。楊帆[14]建立了一種BPIV3、IBRV、BVDV和Mycoplasmabovis多重PCR檢測方法，對BPIV3和BVDV最低檢測量分別為100 pg和1 ng，對IBRV和Mycoplasmabovis的最低檢測量分別為10 pg和100 pg。

基因芯片檢測技術(shù)的應(yīng)用提高了感染性疾病分子診斷的質(zhì)量，同時縮短了分析時間，是一種獨立的可以篩選大量病理標(biāo)本中多個基因的方法[15-17]。用基因芯片方法與用國標(biāo)方法同時檢測30份臨床樣品，符合率為98.6%。本研究所建立的方法可同時檢測牛七種病原，七種病原間無交叉響應(yīng)，與牛其他病原及健康牛血清組織也無響應(yīng)，芯片重復(fù)率可達100%，2～8 ℃保存期可達180 d，完全可以滿足實驗室臨床樣品檢測及流行病學(xué)監(jiān)察。