許 倩，劉良國，黃文軒，林青青，鄧 勇，吳 丹，楊品紅

（1.湖南文理學院生命與環(huán)境科學學院/水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心/環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室/動物學湖南省高校重點實驗室，湖南 常德 415000；2.中南大學生命科學學院，長沙 410000）

大鰭鳠Mystus macropterus 屬鲇形目Siluriformes鲿科Bagridae 鳠屬Mystus，俗稱石扁頭、石胡子，主要分布在長江中、上游水域，是一種喜流水環(huán)境生活的底棲經(jīng)濟魚類[1]。由于其營養(yǎng)豐富、肉味鮮美、無肌間刺，具有較高的食用價值，因而市場需求量大，大鰭鱯資源量呈現(xiàn)明顯減少的趨勢。同時，隨著長江干支流水系大量水利水電工程的修建，河流的水文生境發(fā)生變化，極大地改變了大鰭鱯的生活環(huán)境，加之大壩阻隔可能導致的大鰭鱯生殖隔離，都可能使大鰭鱯種群的遺傳結(jié)構發(fā)生改變。因此，為了更好地保護和利用長江水系這一特有的魚類資源，開展其種群的遺傳多樣性研究具有較大的實際意義。近年來，關于大鰭鱯的遺傳多樣性研究，僅見周麗[2]對長江水系4 個不同江段（合川、廣元、岳陽和金口）大鰭鱯進行過遺傳多樣性的RAPD 分析。 五強溪水庫是長江中游支流——洞庭湖水系沅水干流上的最大水電工程，水庫最大壩高85.83 m，正常蓄水位108 m，水庫面積170 km2，干流回水長度150.2 km[3]，壩址多年平均流量2 040 m3/s，年徑流量643 億m3。庫區(qū)主要支流有酉水、武水和辰水，沿岸分布沅陵、瀘溪和辰溪3 個縣城和20 多個鄉(xiāng)鎮(zhèn)。 五強溪水庫從1994年建成至今已有二十多年，開展水庫大鰭鱯種群遺傳多樣性研究，對于進一步理解水電開發(fā)對魚類遺傳多樣性的影響，以及保護與合理利用大鰭鱯這一名貴的野生經(jīng)濟魚類資源具有非常重要的意義。

簡單序列重復區(qū)間（inter-simple sequence repeat，ISSR）擴增多態(tài)性作為近年來廣泛使用的新型分子標記技術，具體檢測樣本量大，引物通用性強，操作簡單，重復穩(wěn)定性好及多態(tài)性高等優(yōu)點，因而在群體遺傳多樣性分析、種質(zhì)保護、親緣關系鑒定、系統(tǒng)演化等方面廣泛應用[4-8]。利用ISSR 分子標記技術對魚類的遺傳多樣性及群體間的遺傳差異進行研究，已見諸多成功報道[9-13]。 本研究采用ISSR 分子標記技術，對洞庭湖水系沅水五強溪水庫的30 個大鰭鱯群體樣本進行遺傳多樣性分析，旨在為水電開發(fā)影響下的大鰭鳠魚類資源保護與可持續(xù)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用野生大鰭鳠活體樣本分別采自洞庭湖水系沅水五強溪水庫沅陵（E 110.39，N 28.46）、瀘溪（E110.73，N28.29）和辰溪（E110.18，N28.02）江段，各江段隨機選取10 尾生長狀況良好的大鰭鱯標本（沅陵、 瀘溪、 辰溪江段編號分別為1-10、11-20、21-30），30 尾樣本分別剪其背部肌肉，用95%乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA 提取

每個樣品取1.0 g 肌肉提取基因組DNA，按照常規(guī)的酚-氯仿抽提步驟進行。 將提取后的DNA 通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，用紫外分光光度計測定濃度和純度，調(diào)整濃度至40 ng/μL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物序列及篩選

試驗選用的8 條ISSR 引物是由加拿大British Columbia 大學公布的ISSR 引物序列，委托北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。

1.4 ISSR-PCR 擴增

PCR 反應程序設定：94 ℃3 min，95 ℃1 min，52 ℃1 min，72 ℃1.5 min，進行40 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

PCR 反應體系總體積為25 μL，其中40 ng/μL DNA 模板2.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，10 μmol/L ISSR 引物1.0 μL，Taq DNA polymease 1.0 μL（1 U/μL），2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，無菌水補充至25 μL。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)4%的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳（50 W 恒功率2.5 h），經(jīng)ABI PRISM 377 測序儀掃描，得到電泳圖，并以50～1 000 bp 標準分子質(zhì)量進行對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

測序儀掃描所得的電泳圖用GENESCAN3.1 軟件打開，并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用EXCEL 軟件對保存為XLS 格式的結(jié)果構建由“1”和“0”組成的原始二元數(shù)據(jù)矩陣，其中1 / 0 分別代表擴增片段的有或無。 利用Popgene1.32 軟件進行位點總數(shù)和多態(tài)位點數(shù)統(tǒng)計，并計算出多態(tài)位點比率。

根據(jù)M.Lynch[14]的方法計算群體內(nèi)、群體間的遺傳相似指數(shù)和遺傳距離：兩個體間的遺傳相似指數(shù)Sxy=2Nxy/（Nx+Ny），其中Nxy 表示個體x 和y 之間共有的DNA 擴增片段數(shù)，Nx 和Ny 分別是個體x和y 的DNA 擴增片段數(shù)。 群體內(nèi)的遺傳相似指數(shù)S為群體內(nèi)所有的兩個體間遺傳相似指數(shù)的平均值，群體內(nèi)的遺傳距離D=1-S。

最后根據(jù)30 個個體間的遺傳距離，使用MEGA4 軟件包中UPGMA 方法繪制聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR 擴增結(jié)果

本試驗所采用的8 個ISSR 引物擴增條帶穩(wěn)定、清晰，在30 尾大鰭鳠樣本中共檢測出1 162 個擴增位點，其中多態(tài)位點數(shù)占1 141 個，多態(tài)位點比例為98.19%，片段大小在50～1 000 bp 之間（圖1）。 每個引物檢測出的位點數(shù)106～265 個不等，每個引物的多態(tài)位點數(shù)102～263 個不等，不同引物擴增出的多態(tài)位點比例均在95%以上（表1）。

2.2 群體的遺傳相似指數(shù)與遺傳距離

利用相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件計算得到30 個大鰭鱯個體間的遺傳相似指數(shù)在0.871～0.916 之間（表略），平均遺傳相似指數(shù)為0.887；根據(jù)個體間的遺傳相似指數(shù)，計算出個體間的遺傳距離在0.084～0.129 之間（表2），平均遺傳距離為0.113。

圖1 大鰭鱯群體的ISSR 擴增圖譜Figure 1 The ISSR amplified results for the 30 individuals of M.macropterus

表1 ISSR 引物在大鰭 鳠群體中檢測的多態(tài)位點數(shù)及多態(tài)位點比例Table 1 Number of polymorphic loci and the percentage in the population of M.macropterus with a single primer by ISSR analysis

2.3 聚類分析

根據(jù)大鰭鱯群體共30 尾個體之間的遺傳距離數(shù)據(jù)（表2），采用MEGA 軟件包中的UPGMA 方法進行聚類分析，得到沅水五強溪水庫大鰭鱯群體的UPGMA 分支樹狀圖（圖2）。 從分支樹狀圖可見，30個大鰭鳠樣本不以3 個采樣江段而分別聚類，主要聚類成為兩個群體。 其中樣本1、27 聚類成1 個群體，其他28 尾個體聚類成另一個群體。在28 尾個體聚成的群體中又可分為多個小的類群。 聚類結(jié)果表明，大鰭鱯群體內(nèi)遺傳差異明顯，從聚類圖可見，洞庭湖水系沅水五強溪水庫的大鰭鱯至少存在兩個種群的遺傳分化。

3 討論

生物群體的遺傳多樣性是評價生物資源狀況的一個重要依據(jù)，是物種適應多變的環(huán)境條件、維持長期生存和進化的遺傳基礎。 對種群遺傳多樣性的認識對于種質(zhì)鑒定、 資源保護和親本選擇具有重要的意義[15]。 種群的多態(tài)性位點比率能夠很好的反映物種的遺傳多樣性。 本試驗對五強溪大壩阻隔背景下的水庫大鰭鳠種群遺傳結(jié)構及遺傳多樣性狀況進行研究，在30 個樣本中共檢測出1 162 個擴增位點，其中多態(tài)位點數(shù)占1 141 個，多態(tài)位點比率為98.19%，不同引物擴增出的多態(tài)位點比率均在95%以上。 而周麗[2]采用RAPD 分子標記方法，對長江合川、廣元、 岳陽和金口4 個江段大鰭鳠的遺傳多樣性進行研究，總共檢測出139 個位點，其中多態(tài)位點101個，多態(tài)位點百分率為72.66%。 五強溪水庫大鰭鳠群體的多態(tài)位點比率遠高于長江干流4 個江段的大鰭鳠群體，這一方面可能與所采用的分子標記不同有關，ISSR 分子標記具有比RAPD 標記更高的分辨率，檢測出的多態(tài)位點數(shù)多，因而多態(tài)位點百分率高； 另一方面，也可能與五強溪水庫的生境變化相關，水庫大壩建成后，水位上升，分支河汊增多，大鰭鳠從類似靜水湖泊的河流主干游向不同的分支河汊或支流，在不同的分支河汊或支流生境下，大鰭鱯呈現(xiàn)出豐富的遺傳多態(tài)性。 五強溪水庫大鰭鳠的遺傳多態(tài)性，反映出其具有較好的適應不同環(huán)境的能力，有利于大鰭鱯種群的生存與繁衍。

根據(jù)五強溪水庫大鰭鳠群體不同個體間的遺傳距離，得到UPGAM 聚類分支樹狀圖，圖形顯示大鰭鱯群體聚集成兩個類群，其中大的分支類群又分支成許多小的類群，這不僅表明了五強溪水庫大鰭鳠種群的遺傳多態(tài)性，也說明大鰭鱯種群存在明顯的遺傳分化。這一結(jié)果與周麗[2]關于長江水系4 個江段大鰭鳠群體存在遺傳分化的研究結(jié)果一致。 本試驗從水庫的沅陵、瀘溪、辰溪3 個不同江段分別隨機采集10 尾大鰭鱯樣本組成研究群體，聚類結(jié)果表明，3個江段的大鰭鱯個體并沒有依不同江段而聚成3 個大的分支，而是沅陵江段的1 號個體與辰溪江段的27 號個體聚成一個大的分支，瀘溪江段的全部10個個體與沅陵江段、 辰溪江段的另9 個個體聚成另一大的分支。 這說明水庫大鰭鱯種群的遺傳分化并不是因為采樣江段的不同而導致。 3 個江段雖然在地理位置、生境和水文狀態(tài)上存在差異，但仍是一個連續(xù)的水體，不同江段大鰭鱯個體之間必然會存在遺傳基因交流。 而這種基因交流，可能既是水庫大鰭鱯群體產(chǎn)生遺傳多態(tài)性又出現(xiàn)遺傳分化的重要原因。

圖2 基于遺傳距離構建的大鰭鱯30 尾個體的UPGMA 聚類圖Figure 2 UPGMA clustering tree based on genetic distance of 30 individuals of M.macropterus

根據(jù)本文結(jié)果結(jié)合文獻[2]，推測在長江水系的不同水域中，大鰭鱯種群的遺傳多態(tài)性與分化可能是一個普遍存在的現(xiàn)象。 本研究結(jié)果反映了沅水五強溪水庫野生大鰭鳠群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀，這對于了解水電開發(fā)對魚類遺傳多樣性影響及大鰭鳠資源的保護與利用具有較好的理論和實踐指導意義。

C.S.Rubin 等[16]研究指出，物種數(shù)量一定程度的減少，并不一定影響其物種遺傳多樣性水平，然而嚴重的個體數(shù)量減少必定導致遺傳漂變和近親繁殖，這將造成物種遺傳多樣性水平的降低，最終成為許多物種致瀕的原因。 大鰭鱯是長江流域一種特有的優(yōu)質(zhì)魚類資源，近年來，由于過度捕撈、環(huán)境因素等原因，大鰭鳠魚類資源量明顯減少。 因此，盡管本研究結(jié)果表明沅水五強溪水庫大鰭鳠遺傳多樣性豐富，但加強對這一特有優(yōu)質(zhì)魚類資源的保護利用研究，有利于現(xiàn)有野生大鰭鳠種質(zhì)資源量的恢復。