甘盈盈，袁中偉，張?zhí)煲?，谷可欣，?超，申瀚君，周能華，尹立子

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種極其常見的致病菌，數(shù)量大，分布廣，水、空氣、塵土中都可找到它的蹤影。金黃色葡萄球菌可以引起局部化膿性感染、全身炎癥反應(yīng)綜合征和敗血癥等多種疾病，臨床體征較為嚴(yán)重[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）由金黃色葡萄球菌演變而來，毒力和致病力顯著增強(qiáng)，并且具有多重耐藥的特點(diǎn)，臨床治療的難度更大[2]。USA300 是一種具有高度致病性和全球流行性的社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，它對(duì)紅霉素、左氧氟沙星、莫匹羅星和四環(huán)素等抗菌藥物的耐藥性增強(qiáng)。它主要引起皮膚和軟組織感染，還會(huì)造成嚴(yán)重的危及生命的疾病，如壞死性肺炎、骨髓炎、和膿毒性關(guān)節(jié)炎[3-4]。長期以來，萬古霉素是抗MRSA 最有效的藥物，由于萬古霉素的使用量漸增，導(dǎo)致MRSA 對(duì)其抵御能力增強(qiáng)，陸續(xù)出現(xiàn)多種耐藥菌株[5]。因此，為避免臨床上抗MRSA 陷入一種無藥可施的境地，開發(fā)新的抗MRSA 藥物迫在眉睫。

香芹酚，又稱香荊芥酚，是一種單萜酚類化合物。香芹酚廣泛分布于芳香植物中，是麝香草、牛至草、亞加菊等芳香植物揮發(fā)油的主要化學(xué)成分[6-9]。香芹酚既具有分子小、極性低和毒性低等特點(diǎn)[10]，又具有抗菌、抗氧化和抗癌等生物活性[11-12]，因而具有很大的開發(fā)價(jià)值。香芹酚的抗菌活性較好，對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等均有較好的抑制效果[11]，然而目前關(guān)于香芹酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理尚不完全明確。因此本文以MRSA 的標(biāo)準(zhǔn)菌株USA300 為試驗(yàn)菌株，考察香芹酚對(duì)MRSA 的抑菌機(jī)制，為香芹酚開發(fā)為新型天然抑菌藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

MRSA 標(biāo)準(zhǔn)菌株：USA300（ATCC BAA-1717），購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種庫；香芹酚（純度＞98%，上海麥克林生物科技有限公司）用DMSO（分析純，索萊寶生物科技有限公司）配制成母液備用；pH 7.0 的磷酸緩沖鹽粉劑，購自索萊寶生物科技有限公司，按使用說明配制成2 L 的PBS 磷酸緩沖溶液備用；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LB 肉湯和LB 營養(yǎng)瓊脂，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TSB 液體培養(yǎng)基和BHI 液體培養(yǎng)基，購自青島海博生物科技有限公司。

1.2 香芹酚對(duì)USA300 抑菌活性和生長曲線的測定

通過肉湯稀釋法和菌落計(jì)數(shù)法測定香芹酚在37 ℃下作用于USA300 24 h 的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）[13-14]。試驗(yàn)設(shè)立負(fù)對(duì)照組。試驗(yàn)重復(fù)3 次，當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果完全一致或者相差一個(gè)質(zhì)量/體積濃度梯度時(shí)才被接受[15]。

將USA300 菌懸液置于37 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)至OD600nm=0.3，混勻，均分于6 個(gè)50 mL的錐形瓶中，分別加入香芹酚，使其香芹酚的質(zhì)量/體積濃度依次為0、32、64、128、256 和512 μg/mL；將其置于37 ℃、150 r/min 的搖床中培養(yǎng)，分別于0、1、2、4、6、8、16 和24 h 測定肉湯的OD600nm，采用Prism 7.0 繪制生長曲線。

1.3 香芹酚對(duì)USA300 細(xì)胞膜的影響

參考F.Bendali、張冠楠[16-17]等的試驗(yàn)方法，將生長繁殖至對(duì)數(shù)期（OD600nm=1.8）的USA300 菌懸液4 500 r/min、4 ℃離心10 min，棄去上清液，收集下層的細(xì)菌沉淀，用5%葡萄糖溶液懸浮分散成107cfu/mL的菌懸液，混勻，均分于2 個(gè)250 mL 的錐形瓶中；加入香芹酚，使其質(zhì)量/體積濃度分別為0 和512 μg/mL，混勻，置于4 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。于0、1、2、4、6 和8 h 取出菌懸液，4 500 r/min、4 ℃離心10 min，測定上清液的電導(dǎo)率。試驗(yàn)設(shè)立負(fù)對(duì)照組。試驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.4 香芹酚對(duì)USA300 DNA 外滲量的影響

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期（OD600nm=1.8）的USA300菌懸液，4 500 r/min 離心10 min，棄去上清液，收集下層的細(xì)菌沉淀，用PBS 磷酸緩沖溶液重新完全分散成107cfu/mL 的菌懸液，混勻，均分于2 個(gè)250 mL的錐形瓶中；加入香芹酚，使其質(zhì)量/體積濃度分別為0 和512 μg/mL，混勻，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。于0、1、2、4、6 和8 h 取出菌懸液，4 500 r/min 離心10 min，收集上清液，用微量分光光度計(jì)NanoDrop One（Thermo，America）測定上清液中DNA 含量[18]。試驗(yàn)設(shè)立負(fù)對(duì)照組。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.5 香芹酚對(duì)USA300 可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

制備生長繁殖至對(duì)數(shù)期（OD600nm=1.8）的USA 300 菌懸液，混勻，均分于2 個(gè)200 mL 的錐形瓶中，加入香芹酚，使其香芹酚的質(zhì)量/體積濃度分別為0 和512 μg/mL，混勻，置于37 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)。于2、6、10 和16 h 取出菌懸液，用新鮮的LB 肉湯稀釋至OD600nm=0.6，并定容至50 mL，4 500 r/min 離心10 min，棄去上清液，收集下層的細(xì)菌沉淀。用1 mL 的PBS 磷酸緩沖液將細(xì)菌沉淀重新完全分散，進(jìn)行超聲破碎，混勻，得到超聲破碎液；向超聲破碎液中加入5×上樣緩沖溶液（超聲破碎液體積：5×上樣緩沖溶液體積=4∶1），混勻，在沸水浴中煮沸5 min，4 500 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE 試驗(yàn)[19]；按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒的試驗(yàn)方法檢測超聲破碎液中可溶性蛋白質(zhì)的含量。試驗(yàn)設(shè)立負(fù)對(duì)照組。試驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.6 香芹酚對(duì)USA300 乳酸脫氫酶含量的影響

制備生長繁殖至對(duì)數(shù)期（OD600nm=1.8）的USA300菌懸液，混勻，均分于2 個(gè)200 mL 的錐形瓶中，加入香芹酚，使其香芹酚的質(zhì)量/體積濃度分別為0和512 μg/mL，置于37 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)。于0、2、4、6 和8 h 取出菌懸液，用新鮮的LB肉湯稀釋至OD600nm=0.6，并定容至50 mL，4 500 r/min離心10 min，棄去上清液，收集下層的細(xì)菌沉淀，用1 mL 的PBS 磷酸緩沖液重新完全分散，超聲破碎后4 500 r/min 離心10 min，用LDH 試劑盒測定上清液中LDH 的含量[20]。試驗(yàn)設(shè)立負(fù)對(duì)照組。試驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.7 電鏡觀察香芹酚對(duì)USA300 形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

制備生長繁殖至對(duì)數(shù)期（OD600nm=1.8）的USA300菌懸液，混勻，均分至2 個(gè)100 mL 的錐形瓶中，加入香芹酚，使其香芹酚質(zhì)量/體積濃度為0 和512 μg/mL，置于37 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)。于1、10 和16 h 時(shí)取出菌懸液，4 500 r/min 離心10 min，收集下層細(xì)菌沉淀，用PBS 磷酸緩沖液清洗3 次，棄去上清液，得到菌體沉淀[21]，并制成掃描電鏡、透射電鏡樣品[22-24]，于S-3400N 掃描電子顯微鏡（日立，日本）和H-600IV 型透射電鏡（日立，日本）下觀察細(xì)菌表觀形態(tài)與結(jié)構(gòu)的變化。試驗(yàn)設(shè)立負(fù)對(duì)照組。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 亞抑菌濃度下的香芹酚對(duì)USA300 生物被膜形成能力的影響

制備香芹酚質(zhì)量/體積濃度依次為0、16、32、64和128 μg/mL 的BHI 液體培養(yǎng)基（各50 mL），各接種0.5 mL USA300 菌懸液，置于37 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)至OD600nm=0.6。向96 孔板中加入上述菌懸液10 μL，再對(duì)應(yīng)加入含相同質(zhì)量/體積濃度香芹酚的3%蔗糖BHI 液體培養(yǎng)基290 μL，混勻（混合液中香芹酚保持最初的質(zhì)量/體積濃度），置于厭氧條件、37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18 h。清除96 孔板中所有液體后，每孔加入100 μL10%的甲醛溶液，常溫靜置培養(yǎng)18 h；移除所有液體，加入100 μL 質(zhì)量濃度為1 mg/g 的結(jié)晶紫溶液，常溫靜置30 min；清除所有液體，用雙蒸水沖洗，晾干，加入200 μL 33%的乙酸溶液，混勻，用酶標(biāo)儀（Thermo，America）測量OD490nm，以此反映USA300 菌株生物被膜的形成能力[25]。試驗(yàn)設(shè)立負(fù)對(duì)照組。試驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Prism 7.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（t 檢驗(yàn)），結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性及生長曲線的測定

香芹酚具有良好抑菌活性，MIC 是128～256 μg/mL，MBC 是512 μg/mL。香芹酚對(duì)USA300 生長曲線的影響結(jié)果如圖1所示，香芹酚濃度為128、256 和512 μg/mL 時(shí)，對(duì)USA300 的生長有著明顯抑制作用；香芹酚濃度為32 和64 μg/mL 時(shí)，對(duì)USA300 的生長沒有顯著的影響。

圖1 香芹酚對(duì)USA300 生長的影響Figure 1 The effect of carvacrol on the growth of USA300

2.2 香芹酚對(duì)USA300 細(xì)胞膜通透性的影響。

當(dāng)細(xì)胞膜被藥物破壞時(shí)，其滲透性增加，無機(jī)鹽外漏，導(dǎo)致菌懸液的電導(dǎo)率增加[26]，因此本試驗(yàn)通過考察香芹酚作用于USA300 菌懸液后電導(dǎo)率的變化，研究香芹酚對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。由圖2可知，香芹酚作用顯著、迅速；與0 h 相比，香芹酚作用1 h 后，菌懸液電導(dǎo)率增長5.57%±0.40%（P＜0.01）；香芹酚作用8 h 后，菌懸液電導(dǎo)率增長4.22%±0.71%（P＜0.01）。對(duì)照組的電導(dǎo)率在0～8 h 里無顯著變化。相同培養(yǎng)時(shí)間下，給藥組與對(duì)照組組間差異極顯著。

圖2 512 μg/mL 的香芹酚對(duì)USA300 菌懸液電導(dǎo)率的影響Figure 2 The effect of carvacrol at 512 μg/mL on the conductivity of USA300 bacterial suspension

2.3 香芹酚對(duì)USA300 DNA 外滲量的影響

本試驗(yàn)測定了香芹酚作用于USA300 后DNA的外滲量，以此驗(yàn)證香芹酚對(duì)USA300 細(xì)胞膜滲透性的影響。如圖3，與0 h 相比，加入香芹酚1 h 后，USA300 的DNA 外滲量增加（16.27±1.86）μg/mL（P＜0.01）；加入香芹酚8 h 后，USA300 DNA 外滲量增加（21.80±2.00）μg/mL（P＜0.01）。相同培養(yǎng)時(shí)間下，給藥組與對(duì)照組組間差異極顯著。該試驗(yàn)結(jié)果表明香芹酚可以顯著影響USA300 的DNA 外滲量。

2.4 香芹酚對(duì)USA300 可溶性蛋白含量的影響

BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定結(jié)果顯示，與相同培養(yǎng)時(shí)間的對(duì)照組相比，香芹酚作用于USA300菌體10 h 和16 h 后，可溶性蛋白含量分別增加61.13%±7.63%（P＜0.01）和85.76%±1.84%（P＜0.01）。SDS-PAGE 結(jié)果和BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定結(jié)果共同表明了香芹酚可以刺激USA300 可溶性蛋白含量增加。如圖4，SDS-PAGE 蛋白譜帶結(jié)果顯示，香芹酚可以影響USA300 可溶性蛋白含量。

2.5 香芹酚對(duì)USA300 乳酸脫氫酶的影響

LDH 乳酸脫氫酶試劑盒測定結(jié)果如圖5所示，香芹酚作用于USA300 1、2、4、6 和8 h 后，與相同培養(yǎng)時(shí)間的對(duì)照組相比，乳酸脫氫酶的含量分別增加了40.49%±2.77%（P＜0.01）、20.13%±2.28%（P＜0.01）、19.10%±2.82%（P＜0.01）、13.59%±1.35%（P＜0.01）和11.65%±2.85%（P＜0.05）。此試驗(yàn)結(jié)果表明香芹酚可以刺激USA300 的LDH 含量增加。

圖3 512 μg/mL 香芹酚對(duì)USA300DNA 外滲量的影響Figure 3 The effect of carvacrol at 512 μg/mL on DNA exosmosis amount of USA300

圖4 512 μg/mL 香芹酚對(duì)USA300 可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Figure 4 The effect of 512 μg/mL carvacrol on the soluble protein content of USA300

圖5 512 μg/mL 香芹酚對(duì)USA300 的LDH 含量的影響Figure 5 The effect of carvacrol at 512 μg/mL on LDH content of USA300

2.6 香芹酚對(duì)USA300 形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

掃描電鏡圖像顯示，對(duì)照組（圖6A1）的USA300表面光滑，具有正常的表觀形態(tài)；512 μg/mL 香芹酚作用于USA300 1 h 后，菌體表面褶皺，菌體萎縮變形（圖6A2）。透射電鏡圖像顯示，對(duì)照組10 h（圖6B1）和對(duì)照組16 h（圖6C1）菌體表觀正常、結(jié)構(gòu)清晰并具有完整的細(xì)胞壁；512 μg/mL 香芹酚作用于USA300 10 h（圖6B2）后，蛋白質(zhì)異常沉淀，內(nèi)容物固縮，出現(xiàn)空泡化的現(xiàn)象；作用16 h 后（圖6C2），菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，質(zhì)壁分離，出現(xiàn)細(xì)胞壁溶解、脫落的現(xiàn)象。

2.7 香芹酚對(duì)USA300 生物被膜形成能力的影響

低于MIC 的藥物濃度稱為亞抑菌濃度。由圖7可知，加入亞抑菌濃度的香芹酚后，USA300 生物膜的形成比對(duì)照組顯著減少。香芹酚質(zhì)量/體積濃度為16、32、64 和128 μg/mL 時(shí)，形成的生物被膜比對(duì)照組分別減少27.55%±2.33%（P ＜0.01）、35.28%±3.67%（P＜0.01）、68.86%±0.53%（P＜0.01）和77.47%±1.74%（P＜0.01）。該試驗(yàn)結(jié)果表明，香芹酚能抑制USA300 生物被膜的形成。

3 討論與結(jié)論

隨著抗菌藥物的大量使用，細(xì)菌耐藥性呈上升趨勢，MRSA 現(xiàn)已成為臨床上十分常見的致病菌[27-28]。MIC、MBC 和生長曲線試驗(yàn)結(jié)果顯示香芹酚對(duì)USA300 具有較好的抑菌作用，表明香芹酚具有開發(fā)為抗MRSA 的天然抑菌藥的潛在價(jià)值。

圖6 512 μg/mL 香芹酚不同作用時(shí)間對(duì)USA300 菌體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Figure 6 Effect of different treating time of carvacrol at 512 μg/mL on the morphology and structure of USA300 cells

圖7 不同質(zhì)量/體積濃度的香芹酚對(duì)USA300 的生物被膜形成能力的的影響Figure 7 The effect of carvacrol with different mass concentrations on biofilm formation ability of USA300

細(xì)胞膜是保護(hù)細(xì)菌的天然屏障。許多抗菌藥物可以通過改變或損傷細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)使細(xì)菌生長受到抑制乃至死亡，從而達(dá)到抑菌、殺菌的目的[29-30]。本研究中電導(dǎo)率試驗(yàn)表明，香芹酚作用迅速、明顯，與對(duì)照組相比，加入香芹酚1 h 后，菌懸液電導(dǎo)率顯著上升，說明香芹酚可以迅速影響USA300 菌株的細(xì)胞膜通透性。DNA 是一種高分子聚合物，細(xì)菌正常生長情況下，DNA 幾乎不會(huì)通過細(xì)胞膜外滲而出。DNA 外滲量測定結(jié)果表明，香芹酚作用于USA300 菌株1 h 內(nèi)，DNA 外滲量顯著增加，說明香芹酚可以在短時(shí)間內(nèi)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，再次驗(yàn)證電導(dǎo)率的試驗(yàn)結(jié)果。

蛋白質(zhì)是生命中至關(guān)重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，可分為可溶性蛋白和非可溶性蛋白兩大類?？扇苄缘鞍资羌?xì)菌重要的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，它可以提高細(xì)菌的保水能力，保證細(xì)菌的生命活動(dòng)正常進(jìn)行[31]。SDSPAGE 試驗(yàn)結(jié)果和BCA 蛋白濃度測定結(jié)果顯示，香芹酚作用于USA300 菌體后，菌體的可溶性蛋白含量顯著增加，分析原因可能是香芹酚誘導(dǎo)了USA300 抗性蛋白及其相關(guān)蛋白的增加，菌體通過此生命活動(dòng)來抵抗香芹酚的傷害，暗示了干擾蛋白質(zhì)代謝可能不是香芹酚的抑菌機(jī)制。LDH 是一種重要的可溶性蛋白，它對(duì)于金黃色葡萄球菌保持致病力、逃避宿主的先天性免疫是極其重要的[32]。LDH含量測定試驗(yàn)結(jié)果表明，香芹酚作用于USA300 后，菌體內(nèi)LDH 含量明顯增多，其原因可能是香芹酚誘導(dǎo)了USA300 生物酶的表達(dá)，菌體以此來抵抗香芹酚的損傷和維持自身的生長代謝，暗示影響酶的活性可能不是香芹酚發(fā)揮抑菌作用主要途徑，再次驗(yàn)證了SDS-PAGE 試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果。

掃描電鏡和透射電鏡在抑菌機(jī)制的研究中被廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)的圖像表明，香芹酚可以直接損傷菌體的細(xì)胞壁，影響其結(jié)構(gòu)的完整性。細(xì)胞壁可以維持細(xì)菌正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)，當(dāng)香芹酚損傷細(xì)胞壁后，菌體形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)形變萎縮的現(xiàn)象。

細(xì)菌生物被膜既具有天然屏障的作用[33]，又可以改變被膜內(nèi)微環(huán)境[34]，因此極大地增加了細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性。生物被膜試驗(yàn)結(jié)果顯示，亞抑菌濃度下，香芹酚抑制生物被膜形成的能力與香芹酚濃度呈正相關(guān)，且都不影響細(xì)菌的正常生長。此試驗(yàn)結(jié)果表明，亞抑菌濃度下，香芹酚可以有效抑制MRSA 生物被膜的形成，降低耐藥性的產(chǎn)生，進(jìn)一步說明香芹酚具有開發(fā)為抗MRSA 感染藥物的潛力。

綜上所述，香芹酚具有良好的抗MRSA 活性，其抑菌機(jī)制主要是通過破壞USA300 的細(xì)胞壁、改變細(xì)胞膜的通透性來抑制USA300 的生長繁殖，并且其在亞抑菌濃度下能有效抑制生物被膜的形成。其他抑菌機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。