伏圣青，黃哲甦

(天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070)

曲普瑞林為合成的促性腺激素釋放激素十肽類似物，其結(jié)構(gòu)類似戈舍瑞林，以治療劑量持續(xù)給藥時，本品強(qiáng)有力地抑制促性激素的分泌，活性強(qiáng)于天然的GnRH。其注射劑在臨床上有多種用途，其用于臨床中的女性不孕癥、體外受精-胚胎移植程序中誘導(dǎo)排卵、術(shù)前子宮肌瘤的治療、生殖器內(nèi)外的子宮內(nèi)膜異位癥、男性前列腺癌的保守治療以及兒童性早熟[1-6]。目前《美國藥典》、《英國藥典》和《歐洲藥典》均未對該品種進(jìn)行收載，2015版《中國藥典》收載了曲普瑞林原料藥以及0.1 mg/ml規(guī)格制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下采用了主成分自身對照法對單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)進(jìn)行了限定，并未對具體雜質(zhì)做出要求[7]。根據(jù)曲普瑞林的生產(chǎn)工藝相關(guān)文獻(xiàn)資料的研究，在曲普瑞林有關(guān)物質(zhì)中現(xiàn)已確認(rèn)出其中4種已知雜質(zhì)，分別為D-絲氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游離酸及D-亮氨酸7-曲普瑞林。本方法建立了反相高效液相色譜法對曲普瑞林4種已知有關(guān)物質(zhì)及其未知雜質(zhì)進(jìn)行分析測定[8]，為曲普瑞林質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

安捷倫公司1260 高效液相色譜儀；Milli-Q純水儀(Merck公司)； 電子天平(梅特勒-托利多，精度: 十萬分之一)。醋酸曲普瑞林對照品(含量:88.2%，批號1064528)、D-絲氨酸4-曲普瑞林對照品(含量: 80.7%，批號4025363)、D-酪氨酸5-曲普瑞林對照品(含量:80.2%，批號4025365)、游離酸對照品(含量: 79.8%，批號4026526)、D-亮氨酸7-曲普瑞林對照品(含量: 82.6%，批號4025366)、三批醋酸曲普瑞林樣品(批號分別為1058451、1058452、1058454，分別命名為樣品1、樣品2、樣品3)均來自瑞士Bachem AG公司。磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為分析純，乙腈為色譜純(Merck公司)，超純水為Milli-Q自制。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：XTERRA?RP18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.068 mol/L磷酸鹽緩沖液(0.034 mol/L KH2PO4和0.034 mol/L Na2HPO4的水溶液，調(diào)節(jié)pH值至6.85)為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫程序見表1；檢測波長：220 nm；柱溫：35 ℃；流速: 1.5 ml/min；進(jìn)樣量:10 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取醋酸曲普瑞林對照品約20 mg置50 ml 量瓶中，加適量0.1%磷酸溶液使溶解，繼續(xù)用0.1%磷酸溶液稀釋至刻度，混勻，作為對照品貯備液；精密量取醋酸曲普瑞林對照品貯備液5 ml至50 ml量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀釋定容至刻度，搖勻，即得醋酸曲普瑞林對照品溶液。精密稱取D-絲氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游離酸及D-亮氨酸7-曲普瑞林各約10 mg，分別置100 ml量瓶中，加適量0.1%磷酸溶液使溶解，并用0.1%磷酸溶液稀釋至刻度，混勻，作為D-絲氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游離酸及D-亮氨酸7-曲普瑞林對照品貯備液。

2.2.2系統(tǒng)適用性溶液的制備 精密稱取醋酸曲普瑞林約100 mg，置25 ml量瓶中，分別精密加入D-絲氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游離酸及D-亮氨酸7-曲普瑞林對照品貯備液各5 ml使溶解，并用0.1%磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱取樣品1、樣品2、樣品3各約90 mg，分別置25 ml量瓶中，加入適量0.1%磷酸溶液溶解，再加入0.1%磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液1、2、3。

2.3系統(tǒng)適用性考查 在建立的色譜條件下精密量取系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液1各10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，在該色譜條件下系統(tǒng)適用性溶液中的5種成分分離良好，供試品溶液中有關(guān)物質(zhì)準(zhǔn)確檢出，色譜圖見圖1，分離度詳見表2。

表2 5種成分分離度

1．D-絲氨酸4-曲普瑞林 2.D-酪氨酸5-曲普瑞林 3.游離酸 4.曲普瑞林 5.D-亮氨酸7-曲普瑞林 6.未知有關(guān)物質(zhì) 7.未知有關(guān)物質(zhì)圖1 曲普瑞林系統(tǒng)適用性溶液(A)供試品溶液(B)HPLC色譜圖

2.4線性關(guān)系考查及校正因子測定 取“2.2.1”項(xiàng)下對照品貯備液10、7.5、5、2.5和1 ml，分別置于100 ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀釋定容，搖勻；精密量取“2.2.1”項(xiàng)下D-絲氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游離酸及D-亮氨酸7-曲普瑞林貯備液10、7.5、5、2.5和1 ml，分別置于25 ml 量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀釋定容搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以濃度(X，μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y) 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明醋酸曲普瑞林及其4 種有關(guān)物質(zhì)在各自相應(yīng)濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，各有關(guān)物質(zhì)對曲普瑞林的校正因子均在0.95～1.1之間，見表3。

2.5檢測限和定量限的測定 將“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液用流動相逐級稀釋進(jìn)樣，當(dāng)信噪比約為3時，測得為檢出限；當(dāng)信噪比約為10時，測得為定量限。結(jié)果表明，醋酸曲普瑞林、D-絲氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游離酸和D-亮氨酸7-曲普瑞林的檢測限分別為18、15、14、16 和18 ng；定量限分別為36、30、30、32 和36 ng。

表3 線性關(guān)系及校正因子

2.6精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下醋酸曲普瑞林對照品溶液以及“2.2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，重復(fù)進(jìn)樣分析6 次。結(jié)果曲普瑞林、D-絲氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游離酸和D-亮氨酸7-曲普瑞林峰面積的RSD分別為0.3%、0.6%、0.4%、0.7%和0.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品1平行6份，按照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定D-絲氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游離酸和D-亮氨酸7-曲普瑞林含量。結(jié)果6份供試品中均未檢出D-絲氨酸4-曲普瑞林和D-亮氨酸7-曲普瑞林，D-酪氨酸5-曲普瑞林含量的平均值為0.066%,RSD值為1.7%；游離酸含量的平均值為0.19%，RSD值為1.1%，表明重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液在室溫下放置0、12和24 h 后分別進(jìn)樣，考查溶液穩(wěn)定性。結(jié)果24 h內(nèi)系統(tǒng)適用性溶液中D-絲氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游離酸和D-亮氨酸7-曲普瑞林峰面積的RSD分別為1.2%、0.8%、0.6%和1.0%，保留時間的RSD分別為0.1%、0.3%、0.5%和0.3%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9回收率試驗(yàn) 精密稱取已測得雜質(zhì)含量的樣品1約90 mg置25 ml量瓶中，平行配制9份，精密加入D-絲氨酸4-曲普瑞林、D-亮氨酸7-曲普瑞林雜質(zhì)對照品貯備溶液(約0.1 mg/ml)4、5和6 ml，每個濃度平行3份；精密加入D-酪氨酸5-曲普瑞林雜質(zhì)對照品貯備溶液(約0.1 mg/ml)0.6、0.8和1 ml,游離酸雜質(zhì)對照品貯備溶液(約0.1 mg/ml)1.7、2.1和2.5 ml，使加入對照品的量與樣品中原有量之比約為0.8∶1、1∶1和1.2∶1，每個濃度平行3份，然后用0.1%磷酸溶液稀釋定容至刻度，精密量取10 μl進(jìn)樣測定，以測得量與加入量之比計(jì)算回收率。結(jié)果D-絲氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游離酸和D-亮氨酸7-曲普瑞林平均回收率分別為100.3%、99.1%、98.4%和99.0%，RSD分別為1.1%、1.6% 、1.2%和1.0%。4個雜質(zhì)的回收率數(shù)據(jù)見表4-7。

表4 D-絲氨酸4-曲普瑞林回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表5 D-酪氨酸5-曲普瑞林回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表6 游離酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表7 D-亮氨酸7-曲普瑞林回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.10樣品測定 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液1、2、3，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測定，記錄色譜圖，外標(biāo)法計(jì)算各有關(guān)物質(zhì)含量，結(jié)果見表8。

表8 3批樣品中有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

注：“-”代表未檢出

3 討論

現(xiàn)行2015年版《中國藥典》對于醋酸曲普瑞林有關(guān)物質(zhì)的檢查方法采用的是等度色譜方法，對于主成分與游離酸之間的分離度作出了要求，卻并未規(guī)定雜質(zhì)間分離度要求?，F(xiàn)行《中國藥典》有關(guān)物質(zhì)分析方法對于瑞士Bachem AG公司所生產(chǎn)的醋酸曲普瑞林適用性并不理想，所以針對Bachem AG公司產(chǎn)品的實(shí)際情況重新建立醋酸曲普瑞林有關(guān)物質(zhì)的HPLC分析測定方法。

在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)新建立的色譜條件中乙腈比例變化對于醋酸曲普瑞林及其有關(guān)物質(zhì)的保留時間和分離度存在顯著影響，同時溫度對于各物質(zhì)間的分離度也有一定的影響。在最終新建立的梯度色譜條件下，各成分間達(dá)到比較理想的分離，但此系統(tǒng)條件的缺點(diǎn)是各成分保留時間均較大，分析時間長。

本試驗(yàn)對已知雜質(zhì)與曲普瑞林之間的響應(yīng)因子也進(jìn)行了考查，證實(shí)了醋酸曲普瑞林有關(guān)物質(zhì)檢查過程中采用主成分外標(biāo)法的合理性。

本試驗(yàn)過程中新建立的HPLC方法能夠同時準(zhǔn)確方便地測定醋酸曲譜瑞林中多種有關(guān)物質(zhì)，為醋酸曲普瑞林的質(zhì)量控制提供檢測依據(jù)。