陳大為，薛應鈺，沈志彥，毛維興，張樹武，徐秉良

(甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

放線菌存在于各種自然環(huán)境中，種類繁多，代謝功能各異，能夠產(chǎn)生種類豐富具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，被廣泛用于植物病害的防治中[1]。但目前單獨使用生防因子來控制作物病害，往往受到環(huán)境條件等因素的干擾，造成田間防治效果不穩(wěn)定[2]。尤其是為了減輕病害造成的經(jīng)濟損失，多年來都依賴化學殺菌劑，但長期過量使用化學農(nóng)藥對農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)和食用價值產(chǎn)生了嚴重的影響，而且導致病菌抗藥性問題日益突出[3]。因此，有必要在篩選生防菌株的過程中提高和改良野生菌株，選育出耐化學農(nóng)藥的優(yōu)良突變型菌株，為實現(xiàn)生物農(nóng)藥與化學農(nóng)藥的協(xié)同作用提供科學依據(jù)。

目前的菌株改良手段主要有誘變育種[4]、原生質(zhì)體融合[5]和遺傳改造[6]。其中，誘變育種是一種簡便、實用、應用廣泛的菌種改良方法，經(jīng)誘變得到的菌株其生長特性、耐藥性等能力同親本菌株相比大多有所提高[4]。近年來，國內(nèi)利用誘變育種手段來對微生物菌株進行耐藥性改良方面的研究已有相關報道。岳素紅[7]等利用紫外線對球孢白僵菌菌株Bb00進行誘變處理，獲得3株耐800 mg·L-1吡蟲啉的突變菌株。李劍鋒等[8]以紅豆草根瘤菌RS-1為原始菌株進行微波誘變處理，篩選出一株耐80 mg·L-1卡那霉素和300 mg·L-1青霉素菌株RSW-96。田連生[9]等利用紫外線重復誘導處理的方法，對拮抗性木霉T21進行改良，篩選到5株在多菌靈2 000 mg·L-1濃度下仍能較好生長的具有顯著抗性的菌株T21-1～T21-5。但是，目前國內(nèi)利用微波誘變育種手段對放線菌菌株進行耐藥性改造的報道較少。放線菌ZZ-9是前期從蘋果樹根際土壤中分離出的一株生防菌，其發(fā)酵液對蘋果樹腐爛病菌的抑制率為96.4%，在離體枝條上對蘋果樹腐爛病的防效達75%以上[10]。因此，本試驗以放線菌ZZ-9為試驗材料，對其進行微波誘變處理，擬篩選出能夠與甲基硫菌靈混配的突變菌株，為新型農(nóng)藥的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：放線菌(Streptomycesrochei)ZZ-9 和蘋果樹腐爛病菌(Cytosporasp.)由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病原學實驗室提供。

供試藥劑:甲基硫菌靈(70%，可濕性粉劑)由山東曹達化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 出發(fā)菌株的制備 取新鮮斜面培養(yǎng)的放線菌1支，加入5 mL無菌生理鹽水(1%)，用接種針小心刮取斜面孢子使其懸浮于生理鹽水中，充分震蕩，然后將菌液轉(zhuǎn)入無菌管中，經(jīng)無菌濾紙過濾，收集單孢子懸浮液，調(diào)整濃度為106CFU·mL-1左右，即為出發(fā)菌株。

1.2.2 甲基硫菌靈對出發(fā)菌株孢子致死濃度的確定 將制備好的出發(fā)菌株ZZ-9孢子懸液涂布于含濃度分別為0、10、30、50、70 μg·mL-1甲基硫菌靈的高氏一號平板上，每處理3個重復，28℃培養(yǎng)5～7 d，統(tǒng)計不同平板上的菌落數(shù)，并計算致死率。當某個較高濃度平板上未長出菌落時，該濃度即為甲基硫菌靈對出發(fā)菌株孢子的致死濃度。

致死率(%)=(不含甲基硫菌靈平板上長出的菌落數(shù)-含甲基硫菌靈平板上長出的菌落數(shù))/不含甲基硫菌靈平板上長出的菌落數(shù)×100,式中菌落數(shù)單位為CFU·mL-1。

1.2.3 微波誘變劑量的測定及突變菌株的獲得 將裝有出發(fā)菌株ZZ-9孢子懸液的三角瓶置于含有冰塊的燒杯中，于微波爐(生產(chǎn)廠家：格蘭仕微波爐電器有限公司；型號：P70D20P-TD(W0)；輸出功率：750 W；脈沖頻率：2450 MHz)內(nèi)分別照射0、15、30、45、60、75 s。分別取孢子懸液0.1 mL涂布于含致死濃度的甲基硫菌靈和不含甲基硫菌靈的高氏一號平板上，每處理3個重復，28℃培養(yǎng)5～7 d，在含致死濃度甲基硫菌靈的高氏一號平板上長出的菌落即為突變菌株，對其進行編號，統(tǒng)計菌落數(shù)，計算其存活率、致死率和突變率，并將單菌落挑接于高氏一號斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5～7 d，待斜面孢子豐滿，于4℃冰箱保存。

存活率(%)=n1/n0×100

致死率(%)=(n0-n1)/n0×100

突變率(%)=n2/n0×100

式中,n0為出發(fā)菌株在不含甲基硫菌靈的高氏一號平板上長出的菌落數(shù)；n1為出發(fā)菌株微波處理后在不含甲基硫菌靈的高氏一號平板上長出的菌落數(shù)；n2為出發(fā)菌株微波處理后在含致死濃度甲基硫菌靈的高氏一號平板上長出的菌落數(shù)，菌落數(shù)單位均為CFU·mL-1，下同。

1.2.4 耐藥菌株的篩選

(1)耐藥菌株的初篩。采用平板對峙法[11]進行篩選，用“十”字交叉法在 PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)平板背面做標記，中心位置接倒置的蘋果樹腐爛病菌菌餅(d=5 mm)，“十”字兩端等距離( 距中心位置30 mm) 接倒置的各耐藥性菌株和親本菌株(未經(jīng)任何處理的菌株ZZ-9)菌餅，每處理3個重復，以只接蘋果樹腐爛病菌作為對照，28℃下恒溫培養(yǎng)，待對照菌絲鋪滿整個平板時，用十字交叉法測量菌落生長直徑，計算生長抑制率。

生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-5)×100，式中菌落直徑單位為cm,下同。

(2)耐藥菌株的復篩。將耐藥菌株與親本菌株菌體接種在80 mL種子發(fā)酵培養(yǎng)基(液體高氏一號培養(yǎng)基)中，于28℃和180 r·min-1搖瓶培養(yǎng)3 d后，制成種子液，然后再按6%的接種量接入到裝液量為60 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基(小米浸汁培養(yǎng)基)中，在上述條件下振蕩培養(yǎng)4 d后，于4℃、1 000 r·min-1條件下離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔過濾器過濾，收集發(fā)酵濾液(原液)，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用菌絲生長速率法[12]，取制備好的無菌發(fā)酵原液2 mL 與冷至45℃左右的 PDA培養(yǎng)基18 mL加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，混勻制成含發(fā)酵液的平板，在平板中央接入蘋果樹腐爛病菌菌餅(d=5 mm) ，每處理3個重復，以加入無菌水的PDA作對照，28℃下恒溫培養(yǎng)，待對照將鋪滿整個平板時，用十字交叉法測量菌落生長直徑，計算生長抑制率。

生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/

(對照菌落直徑-5)×100

1.2.5 耐藥菌株傳代穩(wěn)定性測定 將篩選出的突變菌株孢子懸浮液分別涂布于含致死濃度甲基硫菌靈和不含甲基硫菌靈的高氏一號培養(yǎng)基上，于 28℃恒溫培養(yǎng)，每 5 d 轉(zhuǎn)接 1 次， 連續(xù)轉(zhuǎn)接10次，每處理3個重復。觀察菌株每次轉(zhuǎn)接后的生長狀況，統(tǒng)計菌落數(shù)，并計算甲基硫菌靈對突變菌株的生長抑制率。

甲基硫菌靈對突變菌株的生長抑制率(%)=

(S1-S2)/S1×100

式中,S1為突變菌株在不含甲基硫菌靈的平板上長出的菌落數(shù)；S2為突變菌株在含致死濃度甲基硫菌靈的平板上長出的菌落數(shù)。

1.2.6 耐藥性菌株與甲基硫菌靈協(xié)調(diào)作用離體枝條測定 采用燙傷接種法[13]，截取10 cm長的離體枝條，先用自來水沖洗干凈，后用75%乙醇消毒15 s，再用無菌水沖洗，置于超凈工作臺晾干，以備試驗用。用鐵釘釘帽(d=5 mm)燙傷枝條，將耐藥性菌株活菌液與甲基硫菌靈藥液分別按9∶1、8∶2、7∶3的比例以及耐藥性放線菌活菌液和甲基硫菌靈單獨處理涂抹于傷口及周圍，晾干后接種培養(yǎng)5 d的蘋果樹腐爛病菌餅(d=5 mm)。共5個處理，每個處理接種6個枝條，每個枝條1個接種點，以先涂抹無菌水后接種病原菌為對照。25℃保濕培養(yǎng)10 d后用“十”字交叉法測量病疤長度，并計算病疤面積和防效。

防治效果(%)=(對照病疤面積-處理病疤面積)/對照病疤面積×100,式中病疤面積單位為mm。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲基硫菌靈對出發(fā)菌株孢子致死濃度的確定

通過甲基硫菌靈對出發(fā)菌株孢子致死濃度的測定，結(jié)果表明(表1)，出發(fā)菌株孢子致死率隨著甲基硫菌靈的濃度增加而升高，當甲基硫菌靈的濃度達到70 μg·mL-1時，出發(fā)菌株孢子致死率為100%，因此當甲基硫菌靈濃度為70 μg·mL-1時為耐藥菌株致死突變標志。

2.2 微波誘變劑量的確定

通過微波對菌株ZZ-9孢子的致死作用和誘變作用測定，結(jié)果表明(表2)，隨著微波時間的增加，菌株ZZ-9孢子存活率下降，致死率逐漸上升，當劑量達到75 s時，存活率為0%，致死率達100%。突變率隨著誘變劑量的增加，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當微波誘變30 s時，突變率最高，達23.62%，以此作為最佳誘變條件。

表1 甲基硫菌靈不同劑量對菌株ZZ-9孢子的處理效果

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著。下同。

Note: Data in the same column followed by different letters are significantly different atP<0.05. The same below.

表2 不同時間微波處理對菌株ZZ-9孢子的致死率與突變率

2.3 耐藥菌株的篩選

2.3.1 耐藥菌株的初篩結(jié)果 通過微波誘變，獲得了4株耐藥菌株，分別為ZZ-9A、ZZ-9B、ZZ-9C、ZZ-9D。將4株耐藥菌株與蘋果樹腐爛病進行平板對峙，結(jié)果表明(表3)，4株耐藥菌株對蘋果樹腐爛病菌均有一定的抑制作用(圖1)，其中菌株ZZ-9B的抑制作用最佳，為77.06%，與親本菌株ZZ-9抑制率相近，僅相差0.81%；菌株ZZ-9C次之，為73.04%；菌株ZZ-9D與ZZ-9A抑制率較低，分別為58.31%、50.12%。

2.3.2 耐藥菌株復篩結(jié)果 通過用菌絲生長速率法對各耐藥菌株進行復篩，結(jié)果表明(表4)，4株耐藥菌株無菌濾液對蘋果樹腐爛病菌均有一定的抑制作用(圖2)，其中耐藥菌株ZZ-9B抑制率最高，為91.75%，與親本菌株ZZ-9抑制率接近，僅相差2.41%，且顯著高于其他耐藥性菌株；耐藥菌株ZZ-9C與ZZ-9D抑制率次之，分別為83.90%、82.29%；菌株ZZ-9A抑制率較低，為79.48%。

2.4 耐藥菌株的傳代穩(wěn)定性測定

通過將上述篩選出的耐藥性菌株連續(xù)10次轉(zhuǎn)接后發(fā)現(xiàn)(表5)，甲基硫菌靈對各耐藥性菌株生長抑制率的影響基本保持穩(wěn)定，表明突變菌株的耐藥性沒有隨著傳代培養(yǎng)而消失。其中ZZ-9B的生長抑制率仍保持最低。因此，將耐藥菌株ZZ-9B確定為最佳耐藥菌株，用于后續(xù)試驗。

2.5 耐藥性菌株與甲基硫菌靈協(xié)同作用對蘋果樹腐爛病的防效

通過協(xié)同作用離體枝條測定，結(jié)果表明(表6，圖3)，耐藥性菌株ZZ-9B 與70 μg·mL-1甲基硫菌靈按3種比例混配后，在離體枝條上對蘋果樹腐爛病的防效達82.01%～89.42%，均顯著高于單獨使用耐藥菌株和甲基硫菌靈藥劑。其中當菌株ZZ-9B和甲基硫菌靈的配比為8∶2時，病疤擴展面積最小，為50.44 mm2，顯著小于對照，防效高達89.42%，而單獨使用耐藥性菌株ZZ-9B和甲基硫菌靈時，病疤擴展面積分別為114.22、98.84 mm2，防效分別為75.97%和79.24%。

3 結(jié)論與討論

微波誘變作為一種新型誘變手段，因其能夠在短時間內(nèi)得到優(yōu)良高效、性質(zhì)穩(wěn)定的突變株，且與傳統(tǒng)的誘變育種方法相比，能夠大幅提高菌株突變率，減少突變譜窄等弊端，目前在微生物菌種改良方面已廣泛應用[14]。本試驗微波輻照30 s條件下，菌株ZZ-9致死率為74.88%，突變率為23.62%，且能夠耐70 μg·mL-1甲基硫菌靈，多代遺傳后耐藥性仍保持穩(wěn)定，且其抑菌率接近原始菌株，與前期研究結(jié)果基本一致。李劍峰等[8]研究發(fā)現(xiàn)在微波輻照30 s條件下，誘變獲得一株耐80 mg·L-1卡那霉素和300 mg·L-1青霉素的雙抗菌株，且多代轉(zhuǎn)接后，遺傳穩(wěn)定性良好。涂璇[15]等研究報道，在微波輻照30 s下，獲得一株耐4 μg·mL-1慶大霉素的菌株。因此，利用微波誘變對放線菌ZZ-9 耐藥菌株進行選育具有可行性。

表3 耐藥性菌株對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用初篩結(jié)果

表4 耐藥性菌株對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用復篩結(jié)果

表5 甲基硫菌靈對轉(zhuǎn)接后各耐藥性菌株的生長抑制率測定

注 Note：(A)ZZ-9；(B)ZZ-9B；(C)ZZ-9C；(D)ZZ-9D；(E)ZZ-9A；(F)對照 Control。圖1 耐藥性菌株對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用初篩結(jié)果Fig.1 First screening results of inhibition effect of chemical-resistant strains to Cytospora sp.

注 Note：(A)ZZ-9；(B)ZZ-9B；(C)ZZ-9C；(D)ZZ-9D；(E)ZZ-9A；(F)對照 Control。圖2 耐藥性菌株對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用復篩結(jié)果Fig.2 Second screening results of inhibition effect of chemical-resistant strains to Cytospora sp.

注：左圖為未去表皮枝條的病疤；右圖為去表皮后枝條的病疤；(A)ZZ-9B∶甲基硫菌靈為8∶2；(B)ZZ-9B∶甲基硫菌靈為7∶3；(C)ZZ-9B∶甲基硫菌靈為9∶1；(D)單獨使用甲基硫菌靈；(E)單獨使用菌株ZZ-9B；(F)空白對照。Note: Left chart shows scar of branches with epidermis; right chart shows scar of branches without the epidermis; (A)Strain ZZ-9B to thiophanate-methyl is 8∶2; (B)Strain ZZ-9B to thiophanate-methyl is 7∶3; (C)Strain ZZ-9B to thiophanate-methyl is 9∶1; (D)Single use thiophanate-methyl;(E)Single use strain ZZ-9B; (F) Control.圖3 耐藥菌株與甲基硫菌靈協(xié)同作用對蘋果樹腐爛病防效Fig.3 The control efficiency of synergistic action of chemical-resistant strains and thiophanate-methyl to Cytospora sp.

表6 耐藥菌株與甲基硫菌靈協(xié)同作用對蘋果樹腐爛病的防效

本試驗中當耐藥菌株ZZ-9B與甲基硫菌靈配比為8∶2時，在離體枝條上對蘋果樹腐爛病的協(xié)同防效為89.42%，明顯高于單獨使用突變菌株和甲基硫菌靈的防效。目前，國內(nèi)利用甲基硫菌靈與生防菌株混合對植物協(xié)同作用方面的研究已有報道。劉淑娟等[16]報道，利用0.001 mg·mL-1甲基硫菌靈與4種生防芽孢桿菌混配對茄腐鐮刀菌的抑制作用可達78.21%～80.93%，均高于二者單獨使用時的抑制率。周勇等[17]研究報道利用耐藥性木霉與1 500倍的甲基硫菌靈混配，對番茄灰霉病的防效為85.90%，顯著高于二者單獨使用時的防效。但是有關甲基硫菌靈與放線菌混配來防治蘋果樹腐爛病的研究報道較少。

利用生防菌與化學藥劑按適當?shù)臐舛然炫?，既發(fā)揮了農(nóng)藥殺菌速度快、防效穩(wěn)定的優(yōu)點，也提高了生防菌的抑菌效果，達到了兩者優(yōu)勢互補、用量減少、防效提高的目的[18]。本研究目前僅限于室內(nèi)試驗，對于該菌株與其化學殺菌劑混配效果及大田應用等問題，有待于進一步研究。