王佳悅 劉香男 彭康莉 趙博

（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240）

泛素化是真核生物體內(nèi)重要的蛋白翻譯后修飾機(jī)制，泛素經(jīng)泛素活化酶E1活化后，在泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3的級(jí)聯(lián)作用下傳遞至底物蛋白，決定底物蛋白的命運(yùn)［1］。之前人們認(rèn)為真核生物體內(nèi)僅存在一種泛素活化酶Uba1（又稱 Ube1）［2-3］，2007年有三篇文章接連報(bào)道發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)泛素活化酶Uba6［4-6］，兩種泛素活化酶E1在將泛素傳遞至各種不同的泛素結(jié)合酶E2時(shí)雖有所重疊，但也各具有不同的活性［4］。真核生物體內(nèi)存在近40個(gè)E2和600多個(gè)E3［7-8］，每個(gè)E2可與多個(gè)E3反應(yīng)每個(gè)E3可識(shí)別多個(gè)底物蛋白進(jìn)行泛素化修飾；多個(gè)E2也可與同一個(gè)E3反應(yīng)，不同的E2-E3配對(duì)可將不同長度和不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的泛素鏈傳遞至底物蛋白上，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的泛素傳遞網(wǎng)進(jìn)而修飾胞內(nèi)蛋白［9］。

鑒于泛素化過程中E1-E2-E3的交叉反應(yīng)性，目前很難針對(duì)某一條特異性的泛素化通路，對(duì)其E2-E3間及E3-底物蛋白間的相互作用進(jìn)行研究，且對(duì)于后發(fā)現(xiàn)的泛素活化酶Uba6的功能研究仍不夠深入。為探究Uba6泛素活化酶介導(dǎo)的泛素化通路，我們已通過正交泛素轉(zhuǎn)移的方法，對(duì)比探索了泛素活化酶Uba1與Uba6在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分別對(duì)應(yīng)的泛素化過程，找到了494個(gè)在Uba1介導(dǎo)的泛素化通路中對(duì)應(yīng)的底物蛋白，528個(gè)在Uba6介導(dǎo)的泛素化通路中對(duì)應(yīng)的底物蛋白及225個(gè)二者的共同底物［10］。盡管Uba6與Uba1有著共同作用的泛素結(jié)合酶E2，但泛素結(jié)合酶USE1被證明是Uba6的特異性E2，與Uba1無交叉反應(yīng)活性［3］，且近期有研究表明，USE1在肺癌細(xì)胞中存在過表達(dá)現(xiàn)象，可能與肺癌細(xì)胞的形成、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散相關(guān)，可作為肺癌發(fā)生的生物標(biāo)記［11］。為進(jìn)一步探究Uba6-USE1這條特異性泛素化通路的功能，我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上，通過RNA干擾技術(shù)構(gòu)建靶向USE1基因的慢病毒載體，包裝感染HEK-293細(xì)胞，抑制細(xì)胞中USE1基因的表達(dá)，后期將與過表達(dá)USE1基因、正常表達(dá)USE1基因細(xì)胞株對(duì)比其細(xì)胞中Uba6-USE1泛素化過程，利用LC-MS液質(zhì)聯(lián)用色譜及生物信息學(xué)方法找出3條USE1基因表達(dá)量不同的泛素化通路中的下游底物，旨為進(jìn)一步研究Uba6-USE1特異性泛素化通路功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎HEK-293細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，慢病毒抑制表達(dá)載體pLL3.7由上海交通大學(xué)藥學(xué)院孫磊惠贈(zèng)；Gel/PCR純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自Favorgen公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamH I，XhoI及其緩沖液、T4 DNA連接酶及其緩沖液、anti-USE1抗體購自Thermo Fisher公司；anti-GAPDH抗體購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技公司；大腸桿菌DH5α菌種購自天根生化科技（北京）有限公司；引物的合成及質(zhì)粒的測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 shRNA的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中USE1基因的mRNA序列（NM_023079），利用Invitrogen公司提供的BLOCK-iTTMRNAi Designer工具，設(shè)計(jì)靶向USE1基因的shRNA序列。選擇5'端以G開頭，GC值在35%-55%之間，且靶點(diǎn)序列起始位置不同的三條序列作為候選，如表1所示。根據(jù)慢病毒抑制表達(dá)載體pLL3.7的特點(diǎn)及要求，在寡核苷酸鏈最兩端加上BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)，并在5'端加上重建U6啟動(dòng)子的T堿基，在shRNA序列后加上Loop環(huán)序列TTCAAGAGA，在3'端加上終止序列TTTTTT。

表1 靶向USE1基因的RNA干擾序列

1.2.2 USE1慢病毒抑制表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將合成好的寡核苷酸單鏈經(jīng)退火后形成雙鏈，酶切保護(hù)堿基后與pLL3.7空載體經(jīng)T4 DNA連接酶作用于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，均勻涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板上，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜，次日挑取單克隆至含相同濃度氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 細(xì)胞的培養(yǎng) 凍存的HEK-293細(xì)胞經(jīng)37℃水浴復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞生長情況適時(shí)更換培養(yǎng)基，一般

2 d傳代一次。

1.2.4 慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞及慢病毒的包裝 當(dāng)HEK-293細(xì)胞融合度達(dá)70%-80%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。將3種含不同干擾序列的pLL3.7-shRNA慢病毒重組質(zhì)粒及作為陰性對(duì)照的pLL3.7慢病毒空載體分別與慢病毒包裝載體psPAX2、VSVG按照質(zhì)量比1∶3∶4混合均勻，加入Opti-MEM培養(yǎng)基；另取相同體積的Opti-MEM培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)染試劑PEI進(jìn)行混合，室溫靜置5 min后，將分別含有質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的兩管Opti-MEM培養(yǎng)基混勻，室溫靜置20 min，更換細(xì)胞培養(yǎng)基為無血清的DMEM，將混合液加至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8 h，更換培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集病毒上清液，離心濃縮，凍存于-80℃。

1.2.5 慢病毒滴度的測(cè)定及最佳稀釋倍數(shù)的確定 將HEK-293細(xì)胞按照每孔2×104個(gè)的密度鋪于96孔板，培養(yǎng)24 h后，用DMEM完全培養(yǎng)基將濃縮后的病毒上清按10倍遞減法依次稀釋，培養(yǎng)48 h后，于熒光顯微鏡下觀察病毒感染細(xì)胞狀況，確定最佳稀釋倍數(shù)，并按照以下公式計(jì)算病毒滴度。

病毒滴度（TU/mL）=熒光細(xì)胞數(shù)/相應(yīng)稀釋倍數(shù)

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot檢測(cè)基因表達(dá)量 病毒感染前一天，按照每孔5×104個(gè)的密度將HEK-293細(xì)胞鋪于24孔板，次日按照最佳稀釋倍數(shù)加入病毒稀釋液感染細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，棄病毒液，更換為DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，通過實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定目的基因的表達(dá)量，其引物序列如下：

按照上述同樣的方法將HEK-293細(xì)胞鋪于24孔板并進(jìn)行病毒感染并培養(yǎng)48 h后，每孔加入適量5×蛋白上樣緩沖液裂解細(xì)胞，收集裂解液并金屬浴加熱10 min使蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳（分離膠濃度為10%），將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至NC膜后，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，洗去膜上殘留的牛奶，分別用anti-USE1抗體（1∶1 000稀釋）和anti-GAPDH抗體（1∶1 000稀釋）敷育，4℃過夜，次日用TNET緩沖液洗膜3次，洗去殘留在膜上的一抗，用相應(yīng)的兔源二抗（1∶10 000稀釋）室溫敷育1 h，用TNET緩沖液洗膜3次后用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 三種USE1抑制表達(dá)慢病毒重組質(zhì)粒pLL3.7-shRNA的鑒定

將構(gòu)建好的質(zhì)粒送去測(cè)序，結(jié)果表明插入序列與shRNA設(shè)計(jì)的目的基因片段完全一致，說明質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 USE1抑制表達(dá)慢病毒重組質(zhì)粒包裝結(jié)果

USE1抑制表達(dá)慢病毒重組質(zhì)粒pLL3.7-shRNA及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞48 h后，于熒光顯微鏡（400×）下觀察，包裝結(jié)果如圖1所示。由于pLL3.7抑制表達(dá)載體可同時(shí)表達(dá)GFP綠色熒光蛋白，慢病毒包裝后的細(xì)胞在藍(lán)色熒光激發(fā)下在視野中呈現(xiàn)綠色，其中分圖AB、CD、EF和GH分別代表3種抑制表達(dá)重組質(zhì)粒pLL3.7-shRNA1，2，3及陰性對(duì)照pLL3.7慢病毒空載體在同一視野下白光和熒光的包裝結(jié)果。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染48 h后，80%以上的HEK-293細(xì)胞均呈現(xiàn)較強(qiáng)綠色熒光，說明3種慢病毒質(zhì)粒及pLL3.7慢病毒空載體均成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，即慢病毒包裝成功。

2.3 病毒滴度測(cè)定結(jié)果及最佳病毒上清稀釋倍數(shù)的確定

將收集的慢病毒上清經(jīng)離心濃縮后，按照10-106倍梯度稀釋后感染細(xì)胞48 h，在400倍放大的熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算得三種抑制表達(dá)USE1的慢病毒質(zhì)粒pLL3.7-shRNA1、pLL3.7-shRNA2、pLL3.7-shRNA3的病毒滴度分別為0.7×106TU/mL，1.0×106TU/mL 和 1.5×106TU/mL，符合滴度要求。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10倍、100倍、1000倍稀釋的病毒感染細(xì)胞后，視野中呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，10倍稀釋的病毒感染細(xì)胞后仍有約70%的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，圖2中A-I分別表示3種pLL3.7-shRNA1，2，3慢病毒包裝上清液在稀釋10倍、100倍、1 000倍后感染HEK-293細(xì)胞在熒光顯微鏡下的結(jié)果。由于濃縮后的病毒上清直接感染細(xì)胞48 h后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故選擇10倍稀釋的病毒上清感染細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中USE1基因的抑制表達(dá)效果

表2顯示了USE1基因的表達(dá)量，將表2中數(shù)據(jù)經(jīng)Graph Pad Prism軟件處理后得到如圖3 所示的結(jié)果。從圖中可以看出，與未經(jīng)病毒感染的空白對(duì)照CON組相比，包裝了pLL3.7-shRNA1質(zhì)粒的慢病毒上清液感染HEK-293細(xì)胞后，USE1基因表達(dá)量沒有明顯減少，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不大（*P＞0.05），而包裝了pLL3.7-shRNA2和pLL3.7-shRNA3重組質(zhì)粒的慢病毒上清感染HEK-293細(xì)胞后對(duì)USE1目的基因有50%的抑制作用（*P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在設(shè)計(jì)的3條shRNA干擾序列中，shRNA2和shRNA3能夠有效抑制HEK-293細(xì)胞中USE1基因的表達(dá)。

圖2 三種梯度稀釋的慢病毒包裝液感染HEK-293細(xì)胞48 h后結(jié)果（400×）

表2 抑制USE1基因表達(dá)量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.5 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中USE1基因的抑制表達(dá)效果

圖3 RT-PCR檢測(cè)USE mRNA在HEK-293細(xì)胞中的表達(dá)（*P＜0.05）

從感染了10倍稀釋慢病毒上清液的HEK-293細(xì)胞中裂解蛋白，經(jīng)Western Blot實(shí)驗(yàn)從蛋白水平上檢測(cè)USE1基因的抑制表達(dá)效果，如圖4-A所示。其中1號(hào)孔為未經(jīng)病毒感染的HEK-293細(xì)胞中USE1基因正常表達(dá)量，2號(hào)孔為陰性對(duì)照即轉(zhuǎn)染了pLL3.7-vector的HEK-293細(xì)胞中USE1基因的表達(dá)量，3-5 孔分別為感染了包裝pLL3.7-shRNA1、pLL3.7-shRNA2、pLL3.7-shRNA3質(zhì)粒的慢病毒上清后細(xì)胞中USE1基因表達(dá)水平，從結(jié)果中可以看出與1號(hào)孔正常HEK-293細(xì)胞USE1基因的正常表達(dá)量和2號(hào)孔陰性對(duì)照組相比，3 號(hào)孔中USE1基因表達(dá)量沒有明顯減少，而4、5 號(hào)孔中USE1基因表達(dá)量明顯降低。經(jīng)灰度量化分析后得到如圖4-B所示的結(jié)果，結(jié)果進(jìn)一步表明，相對(duì)于空白對(duì)照組，包裝了pLL3.7-shRNA2和pLL3.7-shRNA3重組質(zhì)粒的慢病毒上清感染細(xì)胞后具有約50%抑制USE1基因表達(dá)的效果（*P＜0.01）。

3 討論

泛素化作為普遍存在于真核生物體內(nèi)的蛋白翻譯后修飾機(jī)制，在介導(dǎo)內(nèi)源性蛋白降解、調(diào)控細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡、參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、參與DNA損傷修復(fù)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、協(xié)同自噬作用等多個(gè)重要的胞內(nèi)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［12］。泛素化作用底物繁多且通路網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，當(dāng)其機(jī)制出現(xiàn)異常，往往會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白水平失衡，胞內(nèi)多種生理活動(dòng)不能正常進(jìn)行，進(jìn)而引發(fā)包括腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、炎癥及風(fēng)濕性疾病等［13-15］，因此，維持泛素化正常進(jìn)行對(duì)于更新胞內(nèi)蛋白、清除衰老及錯(cuò)誤折疊蛋白、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重大意義［16］。由于泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3成員眾多，彼此間作用相互交錯(cuò)導(dǎo)致目前對(duì)某條特異的泛素化通路中，E2-E3及E3-底物蛋白間的具體的相互作用仍然模糊。而第二個(gè)泛素活化酶Uba6自發(fā)現(xiàn)以來，對(duì)其功能的認(rèn)識(shí)依然不足，而對(duì)其特異性泛素結(jié)合酶USE1的研究更少，對(duì)這條特異性泛素化通路的研究對(duì)發(fā)現(xiàn)泛素活化酶Uba6功能、發(fā)現(xiàn)潛在有價(jià)值的底物蛋白、豐富泛素化理論等方面具有重要意義。

圖4 Western Blot檢測(cè)USE1基因在HKE-293細(xì)胞中的表達(dá)（*P＜0.01）

慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒HIV-1為基礎(chǔ)建立的，對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均有強(qiáng)感染力的一種載體，被廣泛應(yīng)用于RNA干擾技術(shù)、基因治療等研究中［17-18］。當(dāng)慢病毒進(jìn)入細(xì)胞后，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄進(jìn)入細(xì)胞核中，可穩(wěn)定整合至宿主基因組上，通過轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中可產(chǎn)生表達(dá)shRNA的高滴度病毒，實(shí)現(xiàn)在多種細(xì)胞中特異、穩(wěn)定的基因沉默效果［19-20］。根據(jù)靶標(biāo)基因的序列設(shè)計(jì)的shRNA可通過克隆到慢病毒表達(dá)載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后折疊形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA，誘導(dǎo)同源靶基因的mRNA降解，發(fā)揮RNA干擾作用，沉默靶標(biāo)基因的表達(dá)［21］。

基于以上理論基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)在前期探索泛素活化酶Uba1和Uba6分別對(duì)應(yīng)的特異性泛素化通路研究的基礎(chǔ)上，加入了對(duì)Uba6的特異性泛素結(jié)合酶USE1研究，利用慢病毒載體干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)3條靶向USE1基因的shRNA干擾序列，構(gòu)建3種抑制USE1基因表達(dá)的慢病毒載體，經(jīng)慢病毒包裝、感染細(xì)胞后檢測(cè)其抑制USE1基因表達(dá)情況，得到能夠有效抑制USE1基因表達(dá)的細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了3種序列正確的USE1基因抑制表達(dá)慢病毒載體，經(jīng)mRNA水平及蛋白水平檢測(cè)，其中2種慢病毒重組質(zhì)粒經(jīng)包裝轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞后，可有效抑制USE1基因的表達(dá)，編號(hào)分別為shRNA-2、shRNA-3，病毒包裝液感染細(xì)胞后可得抑制USE1基因表達(dá)的細(xì)胞株，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)比、尋找過表達(dá)USE1基因和正常表達(dá)USE1基因細(xì)胞株中泛素化對(duì)應(yīng)的下游底物奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究Uba6-USE1這條特異性泛素化通路的功能提供依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究基于泛素活化酶Uba6及其特異性泛素結(jié)合酶USE1的泛素化通路，為得到USE1基因的抑制表達(dá)細(xì)胞系，設(shè)計(jì)了3條靶向USE1基因的shRNA序列，成功構(gòu)建了3種RNA干擾USE1基因表達(dá)的慢病毒重組質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒包裝感染HEK 293細(xì)胞后檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，最終確定并得到了其中2種抑制USE1基因表達(dá)率在50%左右的shRNA序列及其慢病毒包裝上清液，病毒上清感染細(xì)胞后即可得到抑制USE1基因表達(dá)的細(xì)胞株。