季文博 王會 柴志欣 王吉坤 信金偉 鐘金城

（1. 西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都 610041；2. 西南民族大學(xué) 青藏高原動物遺傳資源保存與利用教育部重點實驗室，成都 610041；3. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850009）

青藏高原作為世界上海拔最高，面積最大的高原，具有高寒、低氧、干燥及紫外線強等特點。牦牛（Bos grunniens）作為青藏高原所特有的一種大型哺乳類動物，為高原牧民提供奶、肉、皮、毛和役力等生產(chǎn)生活資料，是研究高寒耐缺氧的重要經(jīng)濟動物。目前，全世界有牦牛1 400余萬頭，其中95%的牦牛分布于我國，是世界上擁有牦牛數(shù)量和品種（類群）最多的國家［1-4］。

缺 氧 上 調(diào) 蛋 白 1（Hypoxia up regulated 1，HYOU1，又名ORP150）屬于熱休克蛋白70家族，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）中，作為分子伴侶的一個重要組成部分，在蛋白折疊、組裝、分泌和跨膜運輸?shù)冗^程中具有重要功能。HYOU1基因首次在低氧環(huán)境下的大鼠星形膠質(zhì)細胞中被發(fā)現(xiàn)，位于小鼠11號染色體長臂上［5-8］。該基因轉(zhuǎn)錄翻譯起始位點有3個可替換的mRNA片段，能產(chǎn)生缺少N末端的信號肽。研究者還發(fā)現(xiàn)在其5'UTR中存在順式作用元件，與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)；在缺氧狀態(tài)下，該蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量累積，影響蛋白質(zhì)的折疊與分泌。蛋白質(zhì)合成紊亂影響細胞正常生理活動，甚至導(dǎo)致細胞功能障礙及凋亡，表明該基因在缺氧條件下，對細胞功能維持具有重要作用［9］。

HYOU1作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，當(dāng)細胞受外界環(huán)境（低氧、缺血和高溫等）脅迫時，會起到保護細胞及維持細胞活力的作用［10-11］。Liu等［12］研究發(fā)現(xiàn)HSP70能維持PC12細胞中的Ca2+，從而防止細胞凋亡并減少缺氧對心肌細胞的損傷。Wei等［13］通過研究發(fā)現(xiàn)EMF預(yù)處理缺氧心肌細胞后，HSP70表達量顯著提升，使得細胞內(nèi)的Ca2+水平保持穩(wěn)定，從而對缺氧細胞起到保護作用。Montesi等［14］對骨細胞進行低氧處理72 h后發(fā)現(xiàn)，與常氧組相比，低氧組HYOU1mRNA的表達水平顯著提升，而蛋白水平無顯著差異，表明在缺氧條件下，HYOU1對細胞正常功能的維持具有重要作用。Kr?towski等［15］對表皮纖維細胞進行研究時發(fā)現(xiàn)，HYOU1僅在表皮纖維細胞缺氧時才會被誘導(dǎo)表達，表明該蛋白可能在低氧脅迫細胞的保護反應(yīng)中起重要調(diào)控作用。

目前關(guān)于HYOU1基因在牦牛上的研究較少，本研究在克隆HYOU1基因CDS區(qū)的基礎(chǔ)上，利用軟件預(yù)測分析其蛋白質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)等特點，并結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)，探究其在黃牛和牦牛不同組織中的表達譜，旨在為牦牛研究HYOU1的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

各取3頭4.5周歲、健康、生長狀態(tài)良好的牦牛（西藏自治區(qū)類烏齊縣）及三江黃牛（四川省汶川縣三江鎮(zhèn)），屠宰后立即采集其肌肉、大腦、心臟、肺臟、乳腺及肝臟組織，DEPC溶液沖洗后迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成 利用Trizol Reagent提取各組織中的總RNA，并利用電泳及島津Biospec-Nano微量分光光度計檢測RNA的質(zhì)量及濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT-PCR Kit的操作步驟，以各組織提取的RNA為模板，合成cDNA第一鏈。置-20℃冰箱備用。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)黃牛HYOU1基因（XM_005897129.2）序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計 PCR 特異性引物（表1）并由英濰捷基（上海）生物技術(shù)有限公司合成。

表1 HYOU1基因的引物信息

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過生物信息學(xué)預(yù)測分析HYOU1基因編碼蛋白的特性及功能（表2）。

1.2.4 實時熒光定量PCR 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計HYOU1基因及內(nèi)參基因GADPH（XM_01-4482068）的特異性熒光定量引物：HYOU1-F（5'-GAAGACACGAAGCCCATCCC-3'）和HYOU1-R（5'-AGTTCGCTTCTGTCCTGTCG-3'）；GAPDH-F（5'-CCACGAGAAGTATAACAACACC-3'）和GAPDH-R（5'-GTCATAAGTCCCTCCACGAT-3'）。熒光定量反應(yīng)體系（10 μL）：ddH2O 3.2 μL，上下引物各 0.4 μL，模板DNA 1 μL，SYBR premix Dimer Eraser（2×）5 μL，每個反應(yīng)3個平行對照。采用T檢驗法比較HYOU1基因在牦牛及黃牛不同組織中的表達情況，并采用2-ΔΔCT法［16］，計算各自的相對表達量及標準差，研究不同組織間的差異表達情況（P＜0.05）。

表2 DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取

通過 Trizol 法提取各個組織中的總RNA，并利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，提取的RNA無降解，條帶清晰（圖1）。島津Biospec-Nano微量分光光度計檢測RNA的OD260/OD280均在1.9-2.0之間，說明提取的RNA純度高，可滿足后續(xù)實驗需求。

圖1 牦牛組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

利用 TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將檢測合格的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，均出現(xiàn)較亮條帶，與預(yù)期擴增大小一致（圖2）。

圖2 牦牛HYOU1基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

測序發(fā)現(xiàn)成功擴增HYOU1基因的CDS區(qū)。利用DNAstar軟件分析發(fā)現(xiàn)，HYOU1基因CDS區(qū)長度為3 006 bp，其中A、G、C和T含量分別為25.0%、31.1%、26.7%和17.1%，其 中A+T含量42.1%，G+C的平均含量57.9%，存在一定堿基偏好性。

2.2 牦牛HYOU1基因序列分析

西藏牦牛HYOU1測序結(jié)果與黃牛序列進行比對，兩者序列相似性為99.9%。其中第2 643位堿基發(fā)生 1 個堿基突變（ACG→ACA），而氨基酸序列并沒有發(fā)生改變，因此該核苷酸位點突變?yōu)橥x突變（圖3）。

2.3 牦牛HYOU1蛋白質(zhì)分析

圖3 牦牛與黃牛HYOU1基因序列比對結(jié)果

2.3.1 理化性質(zhì)分析 首先利用Expasy 中的Translate工具將核苷酸序列轉(zhuǎn)換成氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)HYOU1基因共編碼1000個氨基酸，共包括 20種氨基酸，其中谷氨酸Glu（11.30%）、亮氨酸Leu（9.90%）、丙氨酸Ala（9.50%）含量較高，組氨酸 His（1.20%）、色氨酸 Trp（0.50%）、半胱氨酸Cys（0.40%）含量較低（圖4），再用 Expasy 中的Protparam 工具預(yù)測HYOU1氨基酸序列的理化性質(zhì)，結(jié)果見表3。

表3 西藏牦牛HYOU1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

2.3.2 親水性/疏水性及亞細胞定位預(yù)測分析 通過Expasy 中的 Protscale 工具分析該蛋白質(zhì)親疏水性，發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列的第 28 號位的亮氨酸疏水性最強，其峰值為1.829；第989、990號位的脯氨酸、蘇氨酸親水性最強，其峰值均為-2.519。分析表明該蛋白質(zhì)存在3個高分值（Scare＞1.0）峰，分別位于19-33、376-381和422-435區(qū)域，而8個低分值（Scare＜-1.5）峰值位于 278-289、585-614、642-682、717-721、748-756、899-920、942-950、969-981區(qū)域（圖5）。該蛋白質(zhì)的總平均親水性為-0.580，屬于親水性蛋白。

圖4 HYOU1氨基酸組成

圖5 牦牛HYOU1蛋白的疏水性/親水性預(yù)測

運用PSORT Prediction 對牦牛HYOU1蛋白亞細胞定位預(yù)測分析，結(jié)果表明其分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（33.3%）、高爾基體（33.3%）、線粒體（22.2%）以及細胞質(zhì)（11.1%），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體中分布較多（表4）。并進一步利用Euk-mPLoc 2.0對HYOU1蛋白質(zhì)進行亞細胞定位預(yù)測和分析，結(jié)果顯示其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，最終認定其分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

表4 亞細胞定位結(jié)果表

2.3.3 蛋白質(zhì)信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 信號肽通常位于分泌蛋白的N端，由3個部分組成：帶正電的N端、中間主要功能區(qū)以中性氨基酸為主、帶負電的小分子氨基酸組成的C端，為信號肽序列切割位點。運用 SignalP 4.1 在線工具對牦牛HYOU1蛋白質(zhì)進行信號肽預(yù)測分析結(jié)果表明，C 最高值為0.436，出現(xiàn)在第35位點纈氨酸（V）上，Y 值的最高峰也出現(xiàn)在35位點纈氨酸（V）上，為 0.622，S-max為 0.989，由于高于閾值0.5，說明其有信號肽且其長度約在34個氨基酸長度，并通過S-mean（0.866）和D值（0.754）能初步判斷其為分泌蛋白（圖6）。

圖6 牦牛HYOU1編碼蛋白信號肽分析

利用TMHMM在線軟件對蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析（圖7），結(jié)果表明HYOU1蛋白質(zhì)中存在一個跨膜螺旋（TMhelix）區(qū)，位于第13-35氨基酸位點。

2.3.4 蛋白磷酸化位點及結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析 利用KinasePhos對HYOU1氨基酸序列進行磷酸化位點預(yù)測（圖8），共發(fā)現(xiàn)磷酸化位點66個，其中絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）和絡(luò)氨酸（Y）分別為33個、29個及4個。

圖7 牦牛HYOU1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析

使用 SMART 在線軟件對HYOU1蛋白質(zhì)進行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測（圖9），結(jié)果表明該氨基酸序列共包含6個低復(fù)雜區(qū)域和1個跨膜區(qū)（第13-35氨基酸位點）結(jié)構(gòu)，并未發(fā)現(xiàn)特殊結(jié)構(gòu)域。

2.3.5HYOU1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用Expasy 中的Sopma工具對HYOU1蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測（圖10），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二級結(jié)構(gòu)中占比最大的是α-螺旋（46.71%）、其次是隨機卷曲（37.92%）和延伸連（10.78%），最少的是β-轉(zhuǎn)角（4.59%）。

通過 Phyre2對HYOU1氨基酸序列進行同源建模，得到三級結(jié)構(gòu)模型，HYOU1蛋白質(zhì)（62%的序列）已被建模，可信度為100%。其中與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的比對中相似度最高的是hsp70，與目標克隆基因一致。三級結(jié)構(gòu)中主要依舊以無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成（圖11），與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致。

2.4 牦牛HYOU1同源性及系統(tǒng)進化分析

利用 MEGA-X 軟件將西藏牦牛與野牦牛、美洲野牛、水牛、普通牛、瘤牛、山羊、歐洲綿羊、盤羊、藏羚羊、智人、小家鼠、褐家鼠及灰倉鼠，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖 12）并用Kimura-Two-Parameter模型計算其遺傳距離（表5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆所得牦牛該基因序列與野牦牛遺傳距離最近，符合實際情況。其中與褐家鼠、小家鼠及灰倉鼠的遺傳距離最遠。該14種動物的總平均值為0.1156325462。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果與遺傳距離分析結(jié)果一致。

2.5 牦牛HYOU1表達譜分析

利用RT-PCR的方法研究HYOU1基因在牦牛及黃牛六個組織器官中mRNA表達水平，結(jié)果表明，HYOU1基因在牦牛及黃牛的六個組織部位廣泛表達，并且在牦牛和黃牛的六個組織部位中的表達趨勢均表現(xiàn)為肝臟＞乳腺＞肺臟＞大腦＞心臟＞肌肉（圖13）；且黃牛HYOU1的表達量均顯著高于牦牛表達量（P＜0.05）（圖 14）。

圖8 牦牛HYOU1蛋白的磷酸化位點分析

圖9 牦牛HYOU1結(jié)構(gòu)域預(yù)測

圖10 牦牛HYOU1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖11 牦牛HYOU1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

汪琦等［9］對牦牛HYOU1基因多態(tài)性研究中發(fā)現(xiàn)該基因存在兩個SNPs位點，推測rs19683位點的突變對牦牛的高原適應(yīng)性具有較大影響，但其未進一步對該基因編碼的氨基酸序列進行近一步研究。目前暫未發(fā)現(xiàn)HYOU1基因在牦牛不同組織中的表達譜及功能研究。

本試驗成功克隆西藏齊牦牛HYOU1基因CDS區(qū)序列，全長3 006 bp，其中A、G、C和T含量分別為25.0%、31.1%、26.7%和17.1%，G+C含量明顯高于A+T含量，存在一定堿基偏好性。HYOU1基因共編碼1 000個氨基酸，通過對西藏牦牛HYOU1基因序列分析比較發(fā)現(xiàn)，僅存在一個1個堿基突變位點，且該位點突變?yōu)橥x突變，氨基酸序列未發(fā)生變換。

表5 HYOU1基因核酸序列同源性比對

圖12 不同哺乳動物HYOU1基因系統(tǒng)進化樹

圖13 HYOU1基因分別在黃牛及牦牛6組織部位不同表達情況圖

圖14 牦牛和黃牛HYOU1基因的mRNA組織表達分析

通過對HYOU1基因編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)HYOU1基因共編碼1 000個氨基酸，相對分子質(zhì)量為 111 499.39，分子式為C4910H7879N1361O1541S27，理論等電點為5.24，一般而言，酸性氨基酸的pI值為2.8-3.2，中性氨基酸的pI值區(qū)間為4.8-6.3，堿基氨基酸pI為7.6-11.0，因此推測其為中性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù) 45.12，大于40，說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；該蛋白的平均親水系數(shù)為負值（-0.580）且脂溶指數(shù)為78.78，為親水性脂溶蛋白［17］。牦牛HYOU1蛋白信號肽預(yù)測分析可初步判定其為分泌蛋白；蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)HYOU1蛋白存在一個跨膜螺旋位于13-35號位的氨基酸序列，與結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果在13-35個氨基酸的位置中出現(xiàn)跨膜區(qū)域結(jié)果一致。亞細胞定位中發(fā)現(xiàn)其主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。二、三級結(jié)構(gòu)分析表明α-螺旋在二級結(jié)構(gòu)中占有最大比重，在三級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、隨機卷曲和延伸鏈占有量最大。

遺傳距離分析表明西藏牦牛與野牦牛的遺傳距離最近，其次為美洲野牛及其他的牛亞科，之后是羊亞科，最遠的是鼠科。結(jié)合遺傳進化樹發(fā)現(xiàn)西藏牦牛在牛亞屬中先與野牦牛聚類后再與美洲野牛匯聚，在之后與普通牛及瘤牛聚集，最后才與水牛匯聚在一起。該結(jié)果與宋大偉在牦牛Y染色體上TSPY、DBY基因及線粒體D-loop區(qū)的序列研究結(jié)果表明，牦牛首先與野牦牛聚類后與美洲野牛聚類后再與普通牛和瘤牛等組成的分支相聚類的說法基本一致［18］。進化樹匯聚方式與動物分類的觀點相一致，首先與牛亞科聚集在一塊，之后才會與同屬于?？频难騺喛萍傲缪?qū)倬奂谝粔K，之后是智人，最后才與鼠科聚集在一塊，說明HYOU1基因在不同的物種內(nèi)都較保守。

組織表達譜分析表明，HYOU1基因在牦牛和黃牛6個組織中廣泛表達，牦牛與黃牛中組織表達量由高到低的排序依次為肝臟、乳腺、肺臟、大腦、心臟和肌肉，其中肝臟的表達量顯著高于HYOU1基因在其他組織部位的表達，可能與肝臟作為一個以代謝為主的器官，在體內(nèi)具有去氧化，儲存肝糖、分泌蛋白質(zhì)合成等重要作用有關(guān)。這與趙成玉等人通過肝細胞低氧處理后發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factors，HIFs）等對肝糖原的調(diào)控，影響了整體血液中的血糖濃度從而適應(yīng)低氧的環(huán)境。因此肝臟作為糖代謝及低氧適應(yīng)性研究中極為重要的一個部位，其表達量可能要高于其他組織器官［19-21］。同一組織部位兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，黃牛HYOU1基因表達量均顯著高于牦牛的表達量（P＜0.05），其中黃牛肝臟的表達量為牦牛肝臟表達量的4.4倍，這可能與牦牛高原適應(yīng)有關(guān)［22］，但是具體機制有待更深一步的研究。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了HYOU1基因的CDS區(qū)，通過信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)HYOU1主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，同時在HYOU1蛋白上既有信號肽又有跨膜區(qū)，是一個分泌性的跨膜蛋白。組織表達譜分析發(fā)現(xiàn)HYOU1基因在牦牛各組織部位的表達量均低于黃牛各個組織部位的表達量。