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      洋蔥伯克霍爾德菌群3種鑒定方法的比較

      2019-05-18 05:39:24楊丹婷蘇嘉妮李婉珊鐘衛(wèi)燁丁清龍
      關(guān)鍵詞:伯克霍爾德洋蔥

      楊丹婷 蘇嘉妮 李婉珊 鐘衛(wèi)燁 王 曦 韋 云 丁清龍 周 露*

      (廣東省食品檢驗(yàn)所 廣東廣州 510435)

      1 前言

      伯克霍爾德菌,原稱為洋蔥假單胞菌,由美國(guó)植物病理學(xué)家Burkholder 于1949年首次發(fā)現(xiàn)。它是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性細(xì)菌。隨著細(xì)菌分類技術(shù)的發(fā)展,伯克霍爾德菌屬包括洋蔥伯克霍爾德菌群(B.cepacia complex)、假鼻疽伯克霍爾德菌(B.pseudomallei)、唐菖蒲伯克霍爾德菌(B.gladioli)、鼻疽伯克霍爾德菌(B.mallei)、泰國(guó)伯克霍爾德菌(B.thailandensis)等 60 多個(gè)菌種,具有復(fù)雜多樣性,既有人畜共患病原菌,也有植物病原菌及環(huán)境分離株,臨床上以洋蔥伯克霍爾德菌較為常見[1,2]。洋蔥伯克霍爾德菌群是基因型不同但表型相近的一組非發(fā)酵復(fù)雜菌群。2001年,Coneyet 等利用rRNA-DNA 雜交全細(xì)胞電泳和細(xì)菌表型標(biāo)志物等方法將洋蔥伯克霍爾德菌群分為9種基因型[3,4]。

      洋蔥伯克霍爾德菌群廣泛存在于自然界和醫(yī)院環(huán)境中,是一種常見的條件致病菌,常引起囊性纖維化疾病和慢性肉芽腫。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域洋蔥伯克霍爾德復(fù)合群感染已呈上升趨勢(shì),可引起多種部位的感染,可引起爆發(fā)流行,對(duì)多種抗生素具有耐藥性,治療難度大[5,6]。

      在2018年度廣東省食品檢驗(yàn)所的專項(xiàng)抽檢米面制品、淀粉及其制品專項(xiàng)中發(fā)現(xiàn),廣東省米面制品、淀粉及其制品中存在伯克霍爾德菌屬污染的風(fēng)險(xiǎn)較高,特別是洋蔥伯克霍爾德菌群。目前,國(guó)內(nèi)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中,只有進(jìn)出口口腔清潔類產(chǎn)品和進(jìn)出口化妝品中有洋蔥伯克霍爾德菌的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),且鑒定的主要方法是生理生化實(shí)驗(yàn)[7,8]。2014年,高業(yè)成等建立了可以有效排除雜菌干擾檢測(cè)出食品樣品中的洋蔥伯克霍爾德菌的方法[9]。2016年,胡娟等用生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合PCR 方法鑒定飲水中洋蔥伯克霍爾德菌[10]。在食品行業(yè)沒(méi)有洋蔥伯克霍爾德菌群鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此,探究準(zhǔn)確高效的洋蔥伯克霍爾德菌群鑒定方法,可為食品標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù),提高食品安全保障。

      目前,傳統(tǒng)生化方法和臨床上應(yīng)用的 VITEK 2 COMPACT 不能準(zhǔn)確區(qū)分洋蔥伯克霍爾德菌群基因型[11]。VITEK MS、分子生物學(xué)手段是近年發(fā)展起來(lái)并已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定的方法。本文對(duì)從廣東省米面制品、淀粉及其制品中分離的洋蔥伯克霍爾德菌群分別進(jìn)行VITEK 2 COMPACT、VITEK MS 質(zhì)譜鑒定和 16s rDNA 基因測(cè)序,其中,VITEK 2 COMPACT 只能鑒定是洋蔥伯克霍爾德菌群,不能進(jìn)一步細(xì)化; 16s rDNA 雖然可以鑒定出具體菌種,但由于序列相似性太高,鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確; VITEK MS 質(zhì)譜可直接鑒定到種水平,鑒定置信度99%,方便快捷。

      2 材料與方法

      2.1 儀器與試劑

      VITEK 2 Compact 自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃股份有限公司); VITEK MS質(zhì)譜儀(法國(guó)生物梅里埃股份有限公司); Nano 核酸蛋白分析儀(日本島津中國(guó)公司); Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司); T100 PCR 儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

      腦心浸出液肉湯(BHI)(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司); VITEK 2 COMPACT GN 鑒定卡(法國(guó)梅里埃公司); 哥倫比亞血瓊脂平板(北京陸橋技術(shù)股份有限公司); 基質(zhì)液CHCA(法國(guó)梅里埃公司); 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)。

      實(shí)驗(yàn)菌株:均來(lái)源于2018年廣東省米面制品、淀粉及其制品抽檢樣品。具體見表1。

      表1 實(shí)驗(yàn)菌株信息

      (續(xù)表1)

      2.2 實(shí)驗(yàn)方法

      用BHI 將實(shí)驗(yàn)需用菌株進(jìn)行復(fù)蘇。

      2.2.1 VITEK MS 質(zhì)譜儀鑒定

      在48 孔靶板質(zhì)控孔涂校準(zhǔn)菌(在哥倫比亞血瓊脂平板上培養(yǎng)24 h 新鮮的單個(gè)大腸埃希氏菌ATCC-8739 菌落),涂勻后加 1 μL 基質(zhì)液 CHCA,每 16孔區(qū)域涂一個(gè)質(zhì)控孔; 在樣品孔涂勻待測(cè)菌,每涂一個(gè)孔加一次1 μL 基質(zhì)液CHCA,待基質(zhì)液干透后上機(jī)。

      2.2.2 16s rDNA 基因測(cè)序

      (1)DNA 提取。DNA 提取方法參照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)操作說(shuō)明進(jìn)行。

      (2)DNA 濃度測(cè)定。取 3.5 μL 提取的 DNA 于核酸蛋白分析儀上,以無(wú)菌水清洗、DNA 提取試劑 TE 作空白,測(cè)定 DNA 濃度。

      (3)PCR。參照 PCR 試劑盒說(shuō)明書。

      擴(kuò)增體系:DNA 模板 2 μL,上游引物(27F)2 μL,下游引物(1492R)2μL,2×PCR DSmix 25 μL,用超純水補(bǔ)足至50 μL。

      擴(kuò)增條件:94℃,3 min; 94℃,30 s; 60℃,30 s; 72℃,2 min,30 個(gè)循環(huán); 72℃,10 min。

      (4)電泳。取 5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 2%瓊脂糖凝膠電泳,以2 000 bp Marker 作為參照。電泳條件:120 V,40 min。電泳結(jié)束后,于凝膠成像裝置成像。

      (5)測(cè)序。PCR 產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

      3 結(jié)果與分析

      3.1 VITEK 2 COMPACT生化鑒定結(jié)果與分析

      在VITEK 2 COMPACT 生化鑒定實(shí)驗(yàn)中,15 株實(shí)驗(yàn)菌均鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌群,只能鑒定到菌群,不能鑒定到種,可信度范圍為88%~99%,可信度越接近99%,說(shuō)明鑒定結(jié)果越好,詳見表2。15 株實(shí)驗(yàn)菌在 VITEK 2 COMPACT 的 47 個(gè)生化反應(yīng)中,有35 個(gè)生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致; 12 個(gè)生化反應(yīng)結(jié)果有區(qū)別,包括:L-脯氨酸芳氨酶、谷氨酰芳氨酶PNA、D-甘露醇、L-蘋果酸鹽同化、L-組氨酸同化、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、尿素酶、丙二酸鹽、L-乳酸鹽同化、β-丙氨酸芳氨酶 PNA、D-山梨醇、磷酸酶。其中,菌株編號(hào)為 4、5、7 的 3株菌報(bào)告的生化反應(yīng)結(jié)果完全一致,具體生化反應(yīng)詳見表3。其中,存在差異的生化結(jié)果見表4。

      表2 15株實(shí)驗(yàn)菌VITEK 2 COMPACT結(jié)果及可信度

      表3 VITKE 2 COMPACT生化結(jié)果

      表4 15株實(shí)驗(yàn)菌存在差異的生化結(jié)果

      3.2 VITEK MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果與分析

      VITEK MS 質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果可以達(dá)到種的水平。在15株實(shí)驗(yàn)菌中,有13株鑒定為越南伯克霍爾德菌,2株鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌。可信限為99.8%~99.99%,具體見表5。以2號(hào)和3號(hào)實(shí)驗(yàn)菌為例,2種菌的峰值圖分別如圖1和圖2所示。

      表5 VITEK MS鑒定結(jié)果

      3.3 16s rDNA基因測(cè)序結(jié)果與分析

      在16s rDNA 基因測(cè)序鑒定實(shí)驗(yàn)中,15 株實(shí)驗(yàn)菌DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后,獲得與預(yù)期大小基本一致的1500 bp 左右的目標(biāo)片段,詳見圖3。將測(cè)序結(jié)果在NCBI 中經(jīng)過(guò)BLAST 分析比對(duì),每個(gè)樣品鑒定結(jié)果均有2 個(gè)以上,同源性均在99%以上,結(jié)果包括中心伯克霍爾德菌、洋蔥伯克霍爾德菌、越南伯克霍爾德菌等,詳見表6。

      3.4 3種鑒定方法比較分析

      3.4.1 鑒定結(jié)果比較

      比較3種鑒定方法的結(jié)果,詳見表7。VITEK 2 COMPACT 只能鑒定是洋蔥伯克霍爾德菌群,不能進(jìn)一步細(xì)化,可信度范圍為88%~99%; 16s rDNA基因測(cè)序可以鑒定到種水平,序列同源性均在99%以上; VITEK MS 質(zhì)譜可直接鑒定到種水平,可信限為99.8%~99.99%。

      圖1 越南伯克霍爾德菌峰值圖(2號(hào))

      圖2 洋蔥伯克霍爾德菌峰值圖(3號(hào))

      圖3 15株實(shí)驗(yàn)菌16s rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

      表6 16s rDNA基因測(cè)序結(jié)果

      (續(xù)表6)

      菌株編號(hào)為1 和3 的VITEK MS 結(jié)果均為洋蔥伯克霍爾德菌,而16s rDNA 基因測(cè)序結(jié)果均為中心伯克霍爾德菌或伯克霍爾德菌,其余13 株菌用2種鑒定方法結(jié)果一致,VITEK MS 結(jié)果均鑒定為越南伯克霍爾德菌,16s rDNA 基因測(cè)序結(jié)果都有可能為越南伯克霍爾德菌,但不同樣品用16s rDNA 基因測(cè)序方法鑒定的結(jié)果不完全一致。16s rDNA 基因測(cè)序結(jié)果不唯一的原因是,伯克霍爾德菌在16s 序列比較保守,雖然可以鑒定出具體菌種,但由于序列相似性太高,鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確。2017年,黃庭軒等用RecA 序列分析得出伯克霍爾德菌屬內(nèi)各種鑒定有效且接近全基因組分析的結(jié)果[12]。因此,要運(yùn)用分子生物學(xué)手段鑒定洋蔥伯克霍爾德菌群,可先用16s rDNA 基因測(cè)序進(jìn)行初篩,再進(jìn)一步做RecA 基因或全基因組測(cè)序以確定具體的種類。

      表7 3種鑒定方法的結(jié)果

      3.4.2 鑒定時(shí)長(zhǎng)比較

      從鑒定時(shí)長(zhǎng)比較3種鑒定方法:鑒定時(shí)長(zhǎng)從備好上機(jī)用的增菌液或平板后開始計(jì)算,VITEK 2 COMPACT 鑒定時(shí)長(zhǎng)相對(duì)較長(zhǎng),VITEK MS 最短,詳見表8。

      表8 3種方法的鑒定時(shí)長(zhǎng)比較

      4 結(jié)語(yǔ)

      在3種鑒定方法中,VITEK 2 COMPACT 鑒定結(jié)果只能到洋蔥伯克霍爾德菌群,鑒定時(shí)長(zhǎng)為7 h或以上; VITEK MS質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果能到種的水平,鑒定時(shí)長(zhǎng)只需要15 min; 16s rDNA 基因測(cè)序法鑒定能到種的水平,但由于伯克霍爾德菌在16s序列比較保守,序列比對(duì)結(jié)果不唯一,不適合鑒定到種。綜上,用VITEK MS 方法鑒定洋蔥伯克霍爾德菌群最佳,該方法結(jié)果準(zhǔn)確,時(shí)效性高。

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