基于純培養(yǎng)方法和PacBio三代測序技術(shù)研究蒙古國傳統(tǒng)酸馬奶中乳酸菌多樣性

劉文俊 多拉娜 劉亞華 任冬艷 張和平 孟和畢力格

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018）

酸馬奶是以新鮮馬奶為原料，經(jīng)乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然發(fā)酵形成的酸性、 低酒精含量的乳飲料[1]。酸馬奶中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、維生素、氨基酸等營養(yǎng)成分。有研究表明：在所有可食用畜乳中，馬乳的組成最接近人乳[2]。除營養(yǎng)豐富外，酸馬奶還具有驅(qū)病保健的功效，蒙醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究表明酸馬奶具有降血壓，降血脂，防止肺結(jié)核，治療便秘、黃褐斑等療效[2-4]。目前在蒙古國和內(nèi)蒙古等地區(qū)均設(shè)立了“酸馬奶療養(yǎng)中心”，利用酸馬奶治療心血管系統(tǒng)病、消化系統(tǒng)病、 神經(jīng)系統(tǒng)疾病和結(jié)核等慢性消耗性疾病均有一定療效[5]。酸馬奶中的乳酸菌賦予酸馬奶獨(dú)特風(fēng)味特征，同時(shí)其代謝產(chǎn)物與酸馬奶的醫(yī)療作用密不可分。全面深入了解傳統(tǒng)酸馬奶中的細(xì)菌多樣性和菌群組成，分離篩選具有優(yōu)良特性的乳酸菌菌株，對酸馬奶品質(zhì)改良，工業(yè)化應(yīng)用以及益生菌的開發(fā)利用具有重要意義。

傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法是常用來研究生態(tài)環(huán)境中的微生物組成的經(jīng)典方法，其培養(yǎng)條件具有局限性，有研究表明自然界中只有不到1%的微生物可以培養(yǎng)[6]，這表明純培養(yǎng)方法不能完全揭示樣品中的微生物組成。宏基因組測序技術(shù)的出現(xiàn)為準(zhǔn)確、全面地了解菌相復(fù)雜的環(huán)境樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)提供了有效手段。以PacBio SMRT 為代表的三代測序技術(shù)具有長讀長，高通量的優(yōu)點(diǎn)，通過其特有的CCS 測序模式，將同一條序列多次重復(fù)測序后的結(jié)果相互校正，可以獲得測序質(zhì)量非常高的一致性序列。借助該技術(shù)研究人員可以在“種”水平對樣品中的微生物進(jìn)行分析[7]。

本研究以采集自蒙古國的12 份酸馬奶為對象，通過純培養(yǎng)方法分離樣品中的乳酸菌，并應(yīng)用16S rRNA 測序技術(shù)對其進(jìn)行鑒定。同時(shí)采用PacBio SMRT 測序技術(shù)分析樣品中的乳酸菌多樣性，以期為傳統(tǒng)酸馬奶的品質(zhì)改良和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，為具有良好益生特性的乳酸菌的篩選和研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 本研究用的12 份傳統(tǒng)酸馬奶樣品采自蒙古國的7 個(gè)省區(qū)，具體采樣信息見表1。

表1 蒙古國傳統(tǒng)酸馬奶樣品的采集信息表Table1 Information of traditional koumiss samples in Mongolia

1.1.2 試劑與儀器 MRS 培養(yǎng)基 （CM0785B）和M17 培養(yǎng)基（CM0817B），英格蘭OXOID 公司；蛋白酶K，北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR 試劑，大連TaKaRa 公司；OMEGA DNA isolation kit試 劑 盒，美 國OMEGA 公 司；KAPA HiFiHot-StartReadyMix PCR 試劑盒，美國KAPA 公司；5×TBE 電泳緩沖液 （Tris 堿54 g、Na2EDTA·2H2O 3.72 g、硼酸27.5 g，定容1 000 mL，pH 8.0）、1.0%的瓊脂糖膠 （1.0 g 瓊脂糖溶于100 mL 0.5×TBE緩沖液），天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑公司。

CDS8000 型UPV 凝膠成像分析系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；DYY-12 電泳儀，北京六一儀器廠；ND-1000 型微量紫外分光光度計(jì)，美國Nano Drop 公司；AB/Life 梯度PCR 儀，美國AB公司；Eppendorf 5810R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；Pacifico SMRT RS II 測序平臺(tái)，美國PB 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 將傳統(tǒng)酸馬奶在其發(fā)酵容器中充分?jǐn)嚢韬螅靡埔簶屛? mL 于裝有無菌15 mL 離心管（內(nèi)含0.5 g 滅菌緩沖劑，m淀粉∶m碳酸鈣=50∶1）中，另取30 mL 酸馬奶裝入無菌離心管中，加入10 mL RNA/DNA 樣品保護(hù)劑 （TaKaRa），混勻、標(biāo)號(hào)。將樣品低溫運(yùn)輸，并快速帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存。

1.2.2 乳酸菌的分離與鑒定 乳酸菌的分離采用涂布法，將樣品搖勻，用無菌槍頭吸取0.5 mL 樣品置于4.5 mL 生理鹽水中，充分混勻，以10 倍梯度稀釋法[8]對樣品進(jìn)行稀釋，分別吸取1 mL 稀釋度為10-5，10-6，10-7的稀釋液涂布于含有0.1%抑菌素 （含V放線菌酮∶V多粘菌素=1∶1） 的無菌MRS 和M17 瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h。待菌落形成后，隨機(jī)挑選形態(tài)特征不同的單個(gè)菌落，并記錄其菌落形態(tài)，如顏色、形狀、大小等。將菌落于MRS 或M17 培養(yǎng)基上劃線純化。選取革蘭氏染色陽性，過氧化氫陰性的純培養(yǎng)物作為疑似乳酸菌。將純化后的純培養(yǎng)物加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%谷氨酸鈉的脫脂乳保護(hù)劑，分裝于無菌安瓿管和凍存管中，于-80 ℃保存、備用[9]。

菌株基因組DNA 的提?。翰捎肅TAB-液氮凍融法提取樣品DNA[10]。乳酸菌DNA 的OD260/280值在1.8～2.0 之間即為純DNA 樣品。將提取的基因組DNA 稀釋至100 ng/μL 作為PCR 擴(kuò)增模板。PCR 擴(kuò)增16S rRNA 基因所用引物為通用引物，正向引物為FA-27F （5′-GCAGAGTTCTCGGAGT CACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反 向引 物 為RA -1495 R （5′-AGCGGATCACTTCA CACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA -3′ ）[11]。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：DNA 模板（質(zhì)量濃度100 ng/μL）2 μL，10×Easy Taq Buffer（Mg2+）5 μL，高純度dNTPs（濃度2.5 mmol/L）4 μL，正、反向引物各（濃度10 mmol/L）1.5 μL，DNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，去離子水補(bǔ)充至50 μL[12]。16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃5 min；94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min[13]。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，可觀察到在大約1 500 bp 的位置有一條清晰、明亮的條帶。該條帶無拖尾、彌散現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)明顯非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，說明分析菌株的16S rRNA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物可以滿足測序的要求。將產(chǎn)物擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.2.3 16S rRNA 基因序列測定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 將測序得到的序列應(yīng)用DNA Star 軟件中SeqMan 模塊進(jìn)行整理拼接。利用NCBI 中的BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將分離株的16S rRNA 基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，尋找同源性最高的已知分類學(xué)地位的菌種[14]。同時(shí)，將拼接好的菌株序列上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫（基因登錄號(hào)：MK369822-MK369883）。將待鑒定菌株序列與同源性最高的模式菌株序列應(yīng)用Mega 6.0 軟件進(jìn)行ClustalW比對，運(yùn)用鄰接法（Neighour-joining，N-J）構(gòu)建基于16S rRNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹，比較它們之間的親緣關(guān)系[15-16]。

1.2.4 樣品中微生物宏基因組DNA 的提取 采用OMEGA DNA isolation kit 試劑盒抽提酸馬奶樣品中微生物宏基因組DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)DNA 樣品的完整度、純度以及濃度。上述3 個(gè)條件都滿足后續(xù)試驗(yàn)要求的DNA 樣品暫時(shí)存放于-20 ℃冰箱備用。

1.2.5 文庫構(gòu)建與上機(jī)測序 使用KAPA HiFi HotStart Ready Mix 高保真PCR 試劑盒將滿足要求的DNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。16S rRNA基因序列的正向引物為27F（5′-AGAGTTTGATCMTG GCTCAG-3′），其反向引物為1492R （5′-AC CTTGTTACGACTT-3′）。為了區(qū)分同一個(gè)文庫中的不同樣品，用帶有識(shí)別標(biāo)簽（Barcode）的引物對每個(gè)樣品進(jìn)行PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）：正向引物（10 μmol/L）1.5 μL，反向引物（10 μmol/L）1.5 μL，模板DNA（＜100 ng）1.5 μL，KAPA Mix 25.0 μL，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃末端延伸2 min。各樣品的PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后等質(zhì)量混合，用試劑盒構(gòu)建文庫，根據(jù)廠商提供的說明書嚴(yán)格執(zhí)行。對構(gòu)建好的文庫加測序引物和聚合酶后，使用PacBio RS II 儀器上機(jī)測序。

1.2.6 高質(zhì)量序列的提取 使用RS_ReadsOfinsert.1 對1.2.5 節(jié)中生成的原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制，保留符合以下標(biāo)準(zhǔn)的序列：①最小通過率設(shè)定為5；②最小預(yù)測精確度為90；③最小插入序列長度為1 400 bp；④最大序列長度為1 800 bp。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 根據(jù)標(biāo)記的Barcode 將原始序列劃分到每個(gè)樣品中，然后去掉Barcode和引物序列，使用QIIME 平臺(tái)（v1.70）對高質(zhì)量的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。首先采用PyNAST 將序列校準(zhǔn)排齊后，在97%的相似性條件下劃分操作分類單元 （Operational taxonomic units，OTU）。去除屬于嵌合體OTU 后，使用RDP（Ribosomal Database Project，Release11.5）和Greengenes（v13.8）數(shù)據(jù)庫確定各OTU 的分類學(xué)地位，進(jìn)而計(jì)算各樣品在門、綱、目、科、屬和種水平的相對含量。計(jì)算各組樣本香農(nóng)指數(shù)（Shannon-Wiener index）、辛普森指數(shù)（Simpson index）、超1 指數(shù)（Chao1 index）和發(fā)現(xiàn)的物種數(shù)量指數(shù) （Observed species），用于評(píng)估各樣本α 多樣性。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Origin 8.6 軟件、Graphpad 6.0 和R 語言軟件（v3.3.2）作圖。

1.2.9 核酸序列登記號(hào) 本研究中涉及的序列數(shù)據(jù)已提交MG-RAST 數(shù)據(jù)庫，序列號(hào)為mgp89049。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸馬奶中乳酸菌的純培養(yǎng)法分離鑒定

2.1.1 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和乳酸菌鑒定 從12份蒙古國傳統(tǒng)酸馬奶中分離出62 株革蘭氏陽性、過氧化氫陰性的疑似乳酸菌菌株。

通過16S rRNA 基因序列同源性比對，62 株分離株鑒定為乳酸菌的3 個(gè)屬，6 個(gè)種。將待鑒定菌株序列與同源性最高的模式菌株序列應(yīng)用Mega 6.0 軟件構(gòu)建基于16S rRNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹。蒙古國傳統(tǒng)酸馬奶中分離菌株的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示?？梢钥闯鼍闕MAU20941 和IMAU20954 與糞腸球菌（Enterococcus faecalis）ATCC 19433T聚為一類，且相似性為100%，將其鑒定為糞腸球菌。菌株IMAU20925，IMAU20960，IMAU20965，IMAU20966和IMAU20967 與模式菌株屎腸球菌（Enterococcus faecium）ATCC 19434T聚為一類，且相似性為100%，將其鑒定為屎腸球菌。菌株IMAU20946，IMAU20929，IMAU20950，IMAU20926，IMAU20930，IMAU20951 和IMAU20956 與產(chǎn)馬乳酒乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）ATCC 43761T聚 為一類，且相似性大于99%，將其歸為馬乳酒樣乳桿菌。菌株IMAU20910，IMAU20915 和IMAU20921與嗜熱鏈球菌 （Streptococcus thermophilus）ATCC 19258T聚為一類，且相似性為100%，將其鑒定為嗜 熱 鏈 球 菌。菌 株IMAU20904，IMAU20905，IMAU20906，IMAU20907 等20 株菌株與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 14917T 聚為一類，且相似性大于99%，將這20 株菌株歸為植物乳 桿 菌 。菌 株 IMAU20901，IMAU20903，IMAU20914，IMAU20916 等25 株菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus） ATCC 15009T聚為一類，且相似性為100%，將這25 株菌鑒定為瑞士乳桿菌。

圖1 蒙古國分離株的16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences of the isolates in Mongolia

由16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可知，分離自蒙古國不同地區(qū)的酸馬奶中的62 株乳酸菌鑒定為乳酸菌的6 個(gè)種，包括瑞士乳桿菌（25株）、植物乳桿菌（20 株）、嗜熱鏈球菌（3 株）、屎腸球菌（5 株）、產(chǎn)馬乳酒乳桿菌（7 株）和糞腸球菌（2株）。

2.1.2 蒙古國傳統(tǒng)酸馬奶中優(yōu)勢菌群分析 從12 份酸馬奶中共分離出62 株乳酸菌，分別為3個(gè)屬、6 個(gè)種，分離株信息見表2。12 份樣品中有9份樣品分離出瑞士乳桿菌，共得到25 株，占總分離株的40.32%，說明瑞士乳桿菌為蒙古國不同地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌的優(yōu)勢菌種。從樣品MG3和MG7 分離的菌株類別最多，其中從MG7 分離到的菌株最多，共分離出12 株乳酸菌，分別為瑞士乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和馬乳酒樣乳桿菌。綜上所述，本研究中，傳統(tǒng)酸馬奶樣品的優(yōu)勢菌株為瑞士乳桿菌。

2.2 酸馬奶中乳酸菌宏基因組學(xué)多樣性分析

2.2.1 測序深度評(píng)估 12 份樣品中由于DNA 提取質(zhì)量和測序建庫中出現(xiàn)問題，只有8 份樣品可以滿足測序要求并獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)，因此本研究對滿足測序要求的8 份酸馬奶樣品的宏基因組進(jìn)行分析。8 份酸馬奶樣品共產(chǎn)生44 758 條高質(zhì)量完整的16S rRNA 基因序列，每個(gè)樣品平均為8 846（范圍2 417～11 432）條。根據(jù)97%相似度劃分OTU 后，共得到848 個(gè)具有代表性的OTU。8份樣品中在MG12 樣品中發(fā)現(xiàn)物種數(shù)最多，在MG3 樣品中發(fā)現(xiàn)物種數(shù)最少，具體信息見表3。

表2 蒙古國傳統(tǒng)酸馬奶樣品中菌株分離鑒定結(jié)果Table2 The distribution of lactic acid bacteria from traditional Koumiss in Mongolia

表3 樣品序列豐度及細(xì)菌多樣性信息Table3 Sequence abundance and microbial diversity of samples

根據(jù)表3信息繪制稀疏曲線和香農(nóng)曲線，用于分析和評(píng)價(jià)各樣品測序量是否符合后續(xù)生物學(xué)分析（圖2）。圖2a 稀疏曲線所示，OTU 的數(shù)量未達(dá)到平衡狀態(tài)，這表明隨著測序量的增加，新的細(xì)菌種系將被發(fā)現(xiàn)。而圖2b 顯示的香農(nóng)曲線已達(dá)到水平狀態(tài)，這表明隨著測序量的增加，細(xì)菌多樣性不再改變，說明當(dāng)前測序量可以滿足后續(xù)分析的需要。

圖2 稀疏曲線圖（a）和香農(nóng)多樣性圖（b）Fig.2 Rarefaction curves（a）and shannon diversity index curves（b）

2.2.2 酸馬奶中乳酸菌多樣性分析 在8 份酸馬奶樣品中共檢測到4 個(gè)細(xì)菌門，包括厚壁菌門（98.68%）、變形菌門（1.29%）、放線菌門（0.02%）和擬桿菌門（0.01%），其中厚壁菌門為8 份酸馬奶樣品的優(yōu)勢菌門，擬桿菌門為MG7 樣品特有菌門（0.04%），放線菌門僅存在于MG7、MG10 和MG11樣品中，相對含量分別為0.03%，0.04%和0.10%。

在屬水平上，從8 份酸馬奶樣品中共檢測到24 個(gè)細(xì)菌屬，其中屬于乳酸菌的共5 個(gè)屬，包括乳桿菌屬（95.56%）、乳球菌屬（1.98%）、鏈球菌屬（0.86%）、明串珠菌屬（0.13%）和腸球菌屬（0.03%）。其它一些非乳酸菌屬主要包括假單胞菌屬（0.96%）、醋酸桿菌屬（0.12%）和巨型球菌屬（0.11%）等。8 份樣品中菌屬的相對含量存在差異，MG3 樣品乳桿菌屬最高（99.62%），MG12 樣品的乳桿菌屬相對含量最低（86.83%），其它樣品中乳桿菌屬相對含量均高于95%。MG12 樣品的乳球菌屬相對含量最高（11.05%），而MG3 樣品中乳球菌屬相對含量最低（0.04%）。MG7 樣品中的鏈球菌屬相對含量最高 （3.70%），MG3 樣品中未檢出鏈球菌屬。MG11 樣品中明串珠菌屬最高（0.48%），在MG6、MG8 和MG13 中未檢出明串珠菌屬。MG12 樣品中腸球菌屬最高 （0.12%），MG3、MG8、MG11 和MG13 未檢出腸球菌屬。

圖3 酸馬奶中優(yōu)勢乳酸菌及其相對含量基于屬水平Fig.3 Relative abundance of lactic acid bacteria in the samplesat the genus level

在種水平上，從8 份酸馬奶樣品中共鑒定出42 個(gè)細(xì)菌種，屬于乳酸菌的有17 個(gè)。采用測序技術(shù)捕捉到大部分傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法分離的菌株，具體信息詳見表2。8 份樣品平均相對含量大于0.1%的乳酸菌種有7 個(gè)（圖4），包括：瑞士乳桿菌（94.64%）、乳酸乳球菌（1.70%）、副乳房鏈球菌（0.84%）、棉籽糖乳球菌（0.27%）、腸膜明串珠球菌（0.13%）、開菲爾乳桿菌（0.12%）和產(chǎn)馬乳酒乳桿菌（0.10%），其中瑞士乳桿菌為8 份酸馬奶樣品的絕對優(yōu)勢菌種，其它非乳酸菌菌種主要包括銅綠假單胞菌（0.95%）和溶酪巨球菌（Macrococcuscaseolyticus，0.11%）等。8 份樣品中不同菌種的相對含量存在差異。MG3 樣品的瑞士乳桿菌相對含量最高 （99.28%），MG12 樣品的瑞士乳桿菌相對含量最低（84.1%），其余樣品瑞士乳桿菌相對含量均高于90%。MG12 樣品中的乳酸乳球菌相對含量較高（9.31%），MG3 樣品相對含量最低（0.03%）。MG7 樣品的副乳房鏈球菌最高（3.48%），而MG3樣品中未檢出副乳房鏈球菌。MG12 樣品中棉籽糖乳球菌最高（1.69%），MG3 和MG11 樣品中均未檢出棉籽糖乳球菌。MG13 樣品中的開菲爾乳桿菌最高（0.46%），MG6 樣品中的開菲爾乳桿菌相對含量最低（0.001%）。MG8 樣品中馬乳酒樣乳桿菌最高（0.22%），MG3 樣品中未檢出馬乳酒樣乳桿菌。

圖4 酸馬奶中優(yōu)勢乳酸菌及其相對含量基于種水平Fig.4 Relative abundance of lactic acid bacteria in the koumiss samplesat species level

2.2.3 OTU 水平乳酸菌組成分析 8 份酸馬奶樣品共產(chǎn)生278 個(gè)OTU（圖5a），其中僅出現(xiàn)在一份樣品中的OTU 共有128 個(gè)，占OTU 總數(shù)的46%，然而其所包含的序列數(shù)僅為179 條，占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的0.40%。而8 份樣品中共有的OTU 為35 個(gè)（圖5b），所包含的序列數(shù)為42 446條，共有的OTU 分別占OTU 總數(shù)和質(zhì)控后合格序列數(shù)的12.6%和95.99%。通過RDP 和Greengene 數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，31 個(gè)OTU 被鑒定為瑞士乳桿菌，2 個(gè)OTU 被鑒定為乳酸乳球菌，1 個(gè)OTU被鑒定為銅綠假單胞菌，1 個(gè)OTU 被鑒定為開菲爾乳桿菌，它們所包含的序列分別占質(zhì)控合格序列數(shù)的93.04%，0.93%，0.78%和0.08%。由此可見，本研究的8 份酸馬奶樣品共有大量的核心細(xì)菌菌群，同時(shí)，8 份樣品均存在一些特有OTU，MG3 樣品特有OTU 最少 （3 個(gè)），MG7 和MG6 特有OTU 最多（33 個(gè)）。MG3 特有乳酸菌為希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii），MG6 特有乳酸菌為蕪菁乳桿菌（Lactobacillus rapi），MG7 特有乳酸菌為乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）。此外，不同樣品還包括一些特有的非乳酸菌菌種，例如MG7 特有菌種加納醋酸桿菌 （Acetobacter ghanensis）、piscium 金黃桿菌（Chryseobacteriumpiscium）、解脲金黃桿菌（Chryseobacteriumureilyticum）、解沒食子酸鏈球菌（Streptococcus gallolyticus）和窄食單胞菌（Stenotrophomonas chelatiphaga）。MG8 特有菌種（Stenotrophomonas rhizophila），MG10 特有菌種戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），MG11 特有菌種黃色微球菌（Micrococcusflavus），MG12 特有菌種tilapiae萊茵海默氏菌（Rheinheimeratilapiae），MG13 特有菌種約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacterjohnsonii）。

圖5 酸馬奶樣品中OTU 出現(xiàn)次數(shù)的統(tǒng)計(jì)和不同樣品特有（a）和共有OTU 分析（b）Fig.5 Frequency of occurrences of OTU for common （a） and specific （b） in the koumiss sample

3 討論和結(jié)論

本文采用純培養(yǎng)方法從采集自蒙古國的12份酸馬奶中共分離出62 株乳酸菌，通過16S rRNA 序列比對分析和系統(tǒng)發(fā)育分析對其進(jìn)行種屬鑒定，共鑒定出3 個(gè)細(xì)菌屬，6 個(gè)細(xì)菌種，其中優(yōu)勢細(xì)菌為瑞士乳桿菌，占總分離株的40.32%。孟和畢力格等[17]通過純培養(yǎng)方法研究發(fā)現(xiàn)蒙古國烏蘭巴托市酸馬奶中的優(yōu)勢菌種為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）。Ishii 等[18]用純培養(yǎng)方法研究發(fā)現(xiàn)蒙古國Haruha 和Buriat 地區(qū)酸馬奶中優(yōu)勢菌為植物乳桿菌。這些研究與本研究結(jié)果不同。孫天松等[19]研究發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)酸馬奶優(yōu)勢菌為瑞士乳桿菌。劉芳等[20]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古地區(qū)酸馬奶優(yōu)勢菌為乳酸乳桿菌 （Lactobacillus lactis）。這些研究表明不同國家、同一國家不同地區(qū)酸馬奶中乳酸菌的組成存在較大差異。

利用PacBio SMRT 測序技術(shù)除了檢測到大部分純培養(yǎng)方法分離的菌株外，還檢測到本研究中通過純培養(yǎng)方法未分離的其它菌種，其中也包括一些具有安全風(fēng)險(xiǎn)的細(xì)菌，這些菌株通過純培養(yǎng)方法未分離到，這可能是由于成熟的酸馬奶pH值很低（2.8～3.5），大部分致病菌難以存活。還有少數(shù)通過純培養(yǎng)分離到的菌株未被測序方法檢測到，可能是由于這些細(xì)菌含量較低，目前的測序深度不足以對其進(jìn)行檢測，測序深度的增加可能檢測到這些細(xì)菌[21]。從8 份樣品中共檢出5 個(gè)乳酸菌菌屬，20 個(gè)乳酸菌菌種，其中優(yōu)勢菌種為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），這也證實(shí)之前通過純培養(yǎng)方法得到的部分研究結(jié)論。Oki 等[22]采用454 焦磷酸測序分析采集自蒙古國不同地區(qū)的酸馬奶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌為優(yōu)勢菌種。其木格蘇都等[23]運(yùn)用PacBio SMRT 測序技術(shù)對錫林郭勒盟地區(qū)馬奶動(dòng)態(tài)發(fā)酵過程中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌同樣為該地區(qū)酸馬奶中的優(yōu)勢菌種。本研究利用PacBio SMRT 測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)蒙古國不同地區(qū)酸馬奶的核心菌群幾乎均為瑞士乳桿菌，瑞士乳桿菌在溫度和pH 值的耐受特性方面具有一定的優(yōu)勢，其較強(qiáng)的蛋白水解活性、產(chǎn)乳酸性能等功能特性與最終發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)息息相關(guān)[24-25]。此外，通過PacBio SMRT 測序技術(shù)作者還發(fā)現(xiàn)了許多純培養(yǎng)方法未檢測到的乳酸菌，如乳酸乳球菌、棉籽糖乳球菌、腸膜明串珠球菌、開菲爾乳桿菌和副乳房鏈球菌等。研究發(fā)現(xiàn)，棉籽糖乳球菌可以彌補(bǔ)牛奶中乳酸乳球菌生長緩慢的不足，而乳酸乳球菌可以彌補(bǔ)棉籽糖乳球菌較差的酪蛋白水解活性，它們之間的互補(bǔ)性可能有助于開發(fā)具有新特性的乳制品[26]。副乳房鏈球菌為條件致病菌[27]，通過純培養(yǎng)方法未分離到，這可能是由于傳統(tǒng)酸馬奶的制作多采用開放環(huán)境的自然發(fā)酵工藝導(dǎo)致其存在，然而隨著pH 的降低已經(jīng)失去活性。本研究還發(fā)現(xiàn)8 份酸馬奶雖然擁有大量的核心菌群，但一些樣品中特有的乳酸菌，例如MG3 特有菌種希氏乳桿菌，MG6 特有菌種蕪菁乳桿菌，MG7 特有菌種乳明串珠菌和MG10 特有菌種戊糖乳桿菌，這些乳酸菌可為后續(xù)通過純培養(yǎng)方法分離這些菌株提供一定理論依據(jù)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)不同樣品還存在一些特有的非乳酸菌菌種，例如MG12 特有菌種tilapiae 萊茵海默氏菌，其常見于水體環(huán)境中[28]，部分樣品特有菌株為原料乳中常見的嗜冷菌，例如MG8 特有菌種嗜根寡養(yǎng)單胞菌 （Stenotrophomonas rhizophila），MG7 特有菌種加納醋酸桿菌、 解沒食子酸鏈球菌和解脲金黃桿菌，MG10 特有菌種地衣芽孢桿菌，MG11特有菌種黃色微球菌和MG13 特有菌種約氏不動(dòng)桿菌，這些嗜冷菌可能來源于擠奶設(shè)備和飼料等環(huán)境中[29-32]，說明同一地區(qū)不同牧民家庭生產(chǎn)的酸馬奶中的菌種會(huì)因?yàn)楦髯圆煌纳a(chǎn)方式及作坊環(huán)境而產(chǎn)生差異[33]。然而，在發(fā)酵過程中隨著pH值的下降，這些致病菌死亡，因此用純培養(yǎng)方法未分離到。通過本研究至少檢測到這些菌株曾在酸馬奶發(fā)酵過程中留下的痕跡。

本文采用純培養(yǎng)技術(shù)和PacBio SMRT 測序方法分析了傳統(tǒng)酸馬奶中的乳酸菌多樣性，在12份樣品中共分離到62 株乳酸菌，分別為3 個(gè)屬，6個(gè)種，優(yōu)勢菌種為瑞士乳桿菌。通過PacBio SMRT測序技術(shù)共檢測到細(xì)菌的4 個(gè)門，24 個(gè)屬，42 個(gè)種，其中屬于乳酸菌有5 個(gè)屬，20 個(gè)種。通過測序技術(shù)除檢測到純培養(yǎng)獲得的菌株外，還檢測到一些痕量乳酸菌和其它細(xì)菌種屬的痕跡。利用PacBio SMRT 測序技術(shù)可全面了解酸馬奶中細(xì)菌多樣性，并豐富其中乳酸菌資源數(shù)據(jù)，為后續(xù)優(yōu)良菌種的篩選提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。