白樺脂酸對HepG2細胞的誘導凋亡作用及其機制

李 豪 周萬怡 吳嘉南 陳啟和

（浙江大學食品科學與營養(yǎng)系 杭州310058）

白樺脂酸（Betulinic acid），又名樺木酸，是一種天然存在的五環(huán)三萜類化合物，具有抗炎[1]、抗癌[2]等多種生物活性[3]。在自然界中廣泛存在，其大量存在于樺木屬植物中，在白樺樹皮中含量最為豐富[4]。目前，白樺脂酸的來源主要有3 種：一是從天然植物中提取分離所得；二是以白樺脂醇為前體，通過有機合成所得；三是以白樺脂醇為前體，通過微生物轉化所得。

1995年首次發(fā)現白樺脂酸可以選擇性地殺死人類黑色素瘤細胞[5]，而不殺傷健康細胞，并進一步證實其能誘導腫瘤細胞凋亡[6]。隨后大量試驗表明白樺脂酸具有廣泛的抗腫瘤活性，能誘導多種腫瘤細胞凋亡，包括白血病細胞[7]、腦瘤[8]、神經外胚層瘤[9]、前列腺癌[10]、卵巢癌[11]、乳腺癌[12]、肺癌、結腸癌[13]以及宮頸癌[14-15]等細胞。此外，它還能阻止腫瘤的形成及發(fā)展。

白樺脂酸作為一種有著良好前景的抗腫瘤藥物，目前對人的肝癌細胞HepG2 的作用及其機制還沒有相關的研究報道。本試驗旨在研究白樺脂酸對HepG2 增值、 凋亡的影響及其可能的機制，為其進行臨床抗腫瘤、 抗癌治療提供一些試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

白樺脂酸，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。使用時需要用DMSO 溶解，用無菌的0.22 μm 的有機系濾膜過濾除菌。使用時，先配成5 mg/mL 的母液，然后根據需要用完全培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度。

1.2 細胞

人肝癌HepG2 細胞株，中國科學院細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院化學與細胞生物學研究所。用含有10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素、鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、含5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d 傳代一次，取對數生長期的細胞進行試驗。

1.3 試劑材料

DMEM 培養(yǎng)基，Corning；胎牛血清，杭州四季青生物科技公司；胰酶、青霉素、鏈霉素雙抗，Hy-Clone；PBS 緩沖液（配制：NaCl 0.85 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.85 g，KH2PO40.27 g，蒸餾水1 L）；DMSO、MTT，北京索萊寶生物科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC/PI，聯科生物科技公司AP101-100-kit；細胞周期檢測試劑盒，聯科生物科技公司CCS012；羅丹明123 染色試劑盒，南京凱基生物科技有限公司KGA217。

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO；倒置顯微鏡，德國LEICA；FC500MCL 流式細胞儀，美國貝克曼庫爾特；酶標儀，Thermo 公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 細胞存活率檢測 將處于對數生長期的HepG2 細胞消化傳代，細胞以每孔2.5×105/mL 的密度接種100 μL 于無菌的96 孔板中，在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過夜約24 h 待細胞貼壁后，將原來的培養(yǎng)基吸出，加入含白樺脂酸（終質量濃度分別為2.5，5，10，20，30，40，60，80 μg/mL）的完全培養(yǎng)液，每孔100 μL，各試驗組每組均設6個平行孔，鋪3 個板，分別于24，48，72 h 后終止培養(yǎng)，24 h 換一次藥。試驗中同時設定不加藥物的正常對照組，以及既不加藥物也不加細胞的空白對照組。

加藥培養(yǎng)24，48，72 h 后，小心棄培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h 后，每孔加入150 μL DMSO，充分振蕩10 min溶解紫色結晶，置酶標儀上測定波長570 nm 下的吸光度，間接反應細胞存活率。按照下列細胞存活率計算公式：細胞存活率=試驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.5.2 流式細胞儀檢測凋亡率 取對數生長期細胞以每孔2.5×105/mL 的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，加入0，20，30，40 μg/mL 的白樺脂酸培養(yǎng)液2 mL，每個質量濃度設3 個復孔。48 h 后用胰酶消化細胞，在4 ℃下1 500 r/min 離心5 min收集細胞，每個樣用預冷的PBS 洗2 次。每個樣收集約106個細胞，在每個管里加500 μL 1×Binding Buffer。在避光的環(huán)境中，加入5 μL Annexin VFITC，混勻，再加入5 μL PI，混勻。

此前應從未經藥物干預的細胞中分出3 管細胞，用于設門。具體方法為：空白，只加結合緩沖液；V 單染，加結合緩沖液和5 μL Annexin VFITC，不加PI；PI 單染，加結合緩沖液，5 μL PI，不加Annexin V-FITC。在室溫中避光反應5 min，之后轉入到流式管中。放入冰盒中，等待上流式儀檢測。

結果判讀：散點圖左下象限LL：正常細胞群，Annexin-V （-），PI （-）；右下象限LR：早期凋亡細胞群，Annexin-V （+），PI （-）；右上象限UR：晚期凋亡細胞或死亡細胞群，Annexin-V （+），PI（+）；左上象限UL：機械損傷或壞死細胞群，Annexin-V （-），PI（+）。計算總凋亡率=LR%+UR%。

1.5.3 流式細胞儀檢測細胞周期 取對數生長期細胞以每孔2.5×105/mL 的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，加入0，20，40，80 μg/mL 的白樺脂酸培養(yǎng)液2 mL，每個質量濃度設3 個復孔。48 h 后用胰酶消化細胞，在4 ℃下1 500 r/min 離心5 min 收集細胞，每個樣用預冷的PBS 洗2 次。每個樣收集約106個細胞。棄去PBS 后，加入預冷的75%乙醇，-20 ℃固定過夜。離心收集固定后的細胞，用PBS 洗1 次，離心去上清，加入1 mL DNA Staining solution，渦旋振蕩5～10 s，使其混勻，濃度約為106/mL，室溫避光孵育30 min 后，上流式細胞儀檢測。

1.5.4 線粒體膜電位檢測 取對數生長期細胞以每孔2.5×105/mL 的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，加入不同質量濃度的白樺脂酸培養(yǎng)基處理24 h 后，用胰酶消化細胞，在4 ℃下1 500 r/min離心5 min 收集細胞，每個樣用預冷的PBS 洗2次。每個樣收集約106個細胞。重懸于100～200 μL PBS 中，加入10 μL 羅丹明123（Rh123）染液（1 mg/mL）37 ℃染色10 min，離心收集細胞，PBS洗滌2～3 次后，重懸于PBS 中，流式細胞儀測定熒光強度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。熒光強度的變化與對照比較。

2 結果與分析

2.1 白樺脂酸抑制HepG2 細胞增殖

MTT 試驗結果如圖1所示，不同質量濃度的白樺脂酸均可以抑制HepG2 細胞增殖，并呈劑量和時間依賴關系。隨著白樺脂酸質量濃度的增加，HepG2 細胞存活率在逐漸降低，說明處理相同時間，白樺脂酸的質量濃度越高，對HepG2 的抑制效果越強。結果表明，作用24，48，72 h 的白樺脂酸對于HepG2 細胞的半抑制質量濃度分別為52，26，17.5 μg/mL，這為接下來的試驗提供參考。

白樺脂酸作用后的細胞具有不規(guī)則的細胞巧態(tài)，如圖2b所示。而且細胞核崩裂，染色質濃縮，這是細胞凋亡的重要特征。

圖1 HepG2 細胞存活率隨白樺脂酸質量濃度和時間的變化Fig.1 Cell viability varied with the mass concentration of betulinic acid and time

圖2 白樺脂酸處理前、后的HepG2 細胞形態(tài)變化Fig.2 The photograph of untreated and the treated HepG2 cells at 40 μg/mL betulinic acid

2.2 流式細胞技術檢測白樺脂酸對HepG2 細胞凋亡的影響

為進一步驗證白樺脂酸能否引起人的肝癌細胞HepG2 細胞調亡，采用流式細胞儀對白樺脂酸處理后的細胞進行檢測。細胞經白樺脂酸處理48 h 后，用Annexin V-FITC 和PI 染色，并用流式細胞儀檢測。結果如圖3和表1所示，右下象限Annexin-V（+）/PI（-）（B4）為早期凋亡細胞群，右上象限Annexin-V（+），PI（+）（B2）為晚期凋亡細胞。由圖3可知，隨著白樺脂酸質量濃度的增加，凋亡細胞的比例也在增加，而且大部分被白樺脂酸處理過的細胞集中在B4 區(qū)域，也隨著白樺脂酸質量濃度的增加而增加，說明白樺脂酸主要引起的是早期凋亡。加藥的每一組凋亡率都比空白對照組高很多，如表1。說明白樺脂酸可以有效促進HepG2 細胞凋亡。

2.3 流式細胞技術檢測白樺脂酸對HepG2 細胞周期的影響

細胞周期分布的變化也是細胞凋亡的一個重要指標。培養(yǎng)后的細胞用PI 染色，流式細胞儀檢測周期變化，結果如圖4、圖5所示。通過PI 染色，流式細胞儀檢測HepG2 細胞周期，發(fā)現隨著白樺脂酸質量濃度的增加，G1、G2 期的細胞比例下降，S 期的細胞比例在逐漸增加，說明細胞發(fā)生了S期的阻滯。由于S 期是DNA 復制時期，即說明白樺脂酸阻礙了HepG2 細胞的DNA 合成，從而促進了HepG2 細胞的凋亡。

表1 流式細胞儀檢測HepG2 細胞凋亡率Table1 FCM analysis of the cell apoptosis rates of HepG2 cells

圖3 流式細胞技術檢測各組細胞凋亡結果圖Fig.3 FCM analysis of the cell apoptosis results

圖4 白樺脂酸對細胞周期的影響Fig.4 The influence of betulinic acid on cell cycle

圖5 流式細胞術檢測各組細胞周期結果圖Fig.5 FCM analysis of the cell cycle results

2.4 流式細胞儀檢測白樺脂酸對HepG2 線粒體膜電位的影響

細胞凋亡的早期特征之一便是線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential，MMP）的降低。通過測定線粒體膜電位，可以判斷細胞調亡是否與線粒體途徑有關[16]。染料羅丹明123（Rhodamine123）是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑。用流式細胞儀檢測，通過熒光信號的強弱來檢測線粒體膜電位的變化和凋亡的發(fā)生。用白樺脂酸處理過的HepG2 線粒體膜電位如圖6所示。發(fā)現隨著白樺脂酸質量濃度的增加，線粒體膜電位越來越低，而且用白樺脂酸處理過的HepG2 線粒體膜電位與對照相比，均出現了明顯下降，說明白樺脂酸誘導的HepG2 細胞凋亡可能與線粒體途徑有關。

圖6 白樺脂酸對線粒體膜電位的影響Fig.6 The influence of betulinic acid on mitochondrial membrane potential

3 討論

本試驗研究表明，白樺脂酸可以顯著降低HepG2 細胞的存活率，而且作用相同的時間，藥物濃度越高，對HepG2 細胞的抑制效果越強。作用24，48，72 h 的白樺脂酸對于HepG2 細胞的半抑制質量濃度分別為52，26，17.5 μg/mL。流式細胞儀檢測結果表明，白樺脂酸誘導HepG2 細胞凋亡主要為早期凋亡，且凋亡比例隨白樺脂酸質量濃度的增加而增加。細胞周期的檢測結果表明白樺脂酸的加入使細胞發(fā)生了S 期的阻滯，即白樺脂酸阻礙了HepG2 細胞的DNA 合成。線粒體膜電位的研究結果表明白樺脂酸可以降低線粒體膜電位，說明白樺脂酸誘導的細胞凋亡可能與線粒體途徑有關。

綜上所述，白樺脂酸可抑制HepG2 細胞增殖，誘導HepG2 細胞凋亡，這一機制可能與線粒體途徑有關，通過將細胞阻滯在S 期來實現。本試驗結果為研究腫瘤治療藥物提供了試驗基礎，也為白樺脂酸應用于肝癌的免疫治療提供了新的試驗依據。