米黑根毛霉脂肪酶基因的酵母重組表達(dá)和Kex2位點(diǎn)改造

蔡海鶯 沈靈智 趙敏潔 李 楊 毛建衛(wèi) 馮鳳琴*

（1 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 杭州 310023 2 浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心 杭州310023 3 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州 310058）

sn-1，3 專一性脂肪酶是指特異性水解甘油三酯1，3 位酯鍵的脂肪酶，因其特異性的催化性能，可修飾甘油酯中脂肪酸的組成和分布，是酶法合成功能性結(jié)構(gòu)脂的關(guān)鍵原料之一，已被廣泛應(yīng)用于1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯 （OPO）、類可可脂、1，3-甘二酯和易消化中鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)脂[1-2]。米黑根毛霉脂肪酶（RML）具有較高的比酶活性、熱穩(wěn)定性、溶劑耐受性以及很好的sn-1，3位置專一性等一系列適合工業(yè)化推廣的特點(diǎn)，因而備受青睞[1]，該基因米曲霉宿主異源表達(dá)的重組脂肪酶應(yīng)用范圍最廣[3]。諾維信公司固定化的RML 脂肪酶RM IM 在母乳化結(jié)構(gòu)油脂OPO 的酶法合成應(yīng)用中，展現(xiàn)出極佳的合成效率和市場(chǎng)潛力。然而，該酶制劑價(jià)格較高，限制了其在食品工業(yè)和油脂加工中的進(jìn)一步發(fā)展。

隨著生物學(xué)技術(shù)水平的提高，通過(guò)生物工程方法對(duì)脂肪酶進(jìn)行表達(dá)和分子改造，是目前常用的降低酶生產(chǎn)成本的策略之一[4-5]。巴斯德畢赤酵母（Pachia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)因其高效表達(dá)和分泌，易于基因工程改造，培養(yǎng)發(fā)酵操作體系成熟等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前使用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)[6]。相較于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，具有更高的安全性，以及更好的蛋白翻譯后糖基化修飾能力等。在巴斯德畢赤酵母中獲得成功表達(dá)的重組蛋白超過(guò)600種，其中，Werten[7]通過(guò)蛋白酶缺陷株表達(dá)明膠，實(shí)現(xiàn)了巴斯德畢赤酵母最高的分泌蛋白表達(dá)水平14.8 g/L；Hasslacher 等[8]1997年對(duì)熱帶橡膠的羥基腈裂解酶在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，最終胞內(nèi)該異源蛋白表達(dá)水平達(dá)到驚人的22 g/L，為胞內(nèi)可溶性蛋白的50%以上，是目前已報(bào)道的最高的巴斯德畢赤酵母重組表達(dá)蛋白。工業(yè)化水平的巴斯德畢赤酵母重組表達(dá)已較為成熟。

外源基因的重組表達(dá)往往需要進(jìn)行基因優(yōu)化和設(shè)計(jì)，以獲得更理想的重組表達(dá)水平[9]。蛋白的分子改造過(guò)程是提高酶的催化性能和穩(wěn)定性等特征的有效手段，分子改造的策略包括定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)和半理性設(shè)計(jì)[10-11]。對(duì)RML 脂肪酶氨基酸序列的分析表明，成熟肽196 和197 氨基酸殘基（RML 前體全序列的第291 和292 位）為“-Arg-Arg-”，是潛在的Kex2 酶切位點(diǎn)，可能導(dǎo)致脂肪酶蛋白在畢赤酵母重組表達(dá)過(guò)程中被宿主裂解。本研究利用巴斯德畢赤酵母重組表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)合密碼子優(yōu)化策略，對(duì)表達(dá)sn-1，3 專一性脂肪酶RML進(jìn)行重組表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)脂肪酶RML的分子改造和修飾，研究該蛋白內(nèi)部潛在Kex2 蛋白酶酶切位點(diǎn)對(duì)其在巴斯德畢赤酵母中重組表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株和質(zhì)粒：大腸桿菌 （Escherichia coli）TOP10F’和質(zhì)粒pUC57，蘇州金唯智公司。

重組表達(dá)宿主巴斯德畢赤酵母 （P.pastoris）GS115（His-Mut+）和表達(dá)載體pPIC9K，美國(guó)Invitrogen 公司。

1.2 基因合成及表達(dá)載體構(gòu)建

RML 基因的前導(dǎo)肽和成熟肽由Kex2 識(shí)別序列（-KREAEA-）連接。C 端His Tag 用于RML 檢測(cè)。巴斯德畢赤酵母密碼子使用頻率數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.kazusa.or.jp/） 用于RML 脂肪酶基因（Gen-Bank：A02536.1）優(yōu)化，使目的基因GC 含量接近巴斯德畢赤酵母整體平均GC 含量 （42.73%），同時(shí)避免GC 或AT 局部含量過(guò)高以及影響克隆的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。最終獲得RML 的優(yōu)化基因命名coRML，該基因序列通過(guò)重疊延伸PCR（Splicing by overlap extension，SOE）法合成，并克隆到表達(dá)載體pPIC9K 的多克隆位點(diǎn)EcoR I/Not I，得到coRML 基因表達(dá)載體pP-coRML。

1.3 表達(dá)載體定點(diǎn)突變

coRML 定點(diǎn)突變基因通過(guò)二步法全質(zhì)粒定點(diǎn)突變方法完成[12]，coRML 定點(diǎn)突變基因RM-Q、RM-H 和RM-S 對(duì)應(yīng)的定點(diǎn)突變引物分別為RMQF1 和 RMQR1、RMHF1 和 RMHR1 以 及RMSF1 和RMSR1，引物序列見(jiàn)表1。coRML 定點(diǎn)突變基因以質(zhì)粒pP-coRML 作為模版。通過(guò)二步法PCR 反應(yīng)擴(kuò)增，電泳檢測(cè)PCR 反應(yīng)結(jié)果。加入DpnI 酶和反應(yīng)緩沖液對(duì)PCR 反應(yīng)產(chǎn)物模板DNA做消化處理，37 ℃處理2 h。通過(guò)電泳切膠回收特異性擴(kuò)增片段（10 kb 處條帶），回收產(chǎn)物預(yù)冷后加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，熱激轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇后涂板于LBA 平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑2～3 個(gè)單菌落LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜后提質(zhì)粒，通過(guò)對(duì)質(zhì)粒測(cè)序，確定符合預(yù)期的突變體克隆。各表達(dá)載體的酵母菌株簡(jiǎn)稱為GS-對(duì)應(yīng)基因名，如pP-RM-Q 轉(zhuǎn)化菌株命名為GS-RM-Q 等。

表1 PCR 引物和定點(diǎn)突變引物列表Table1 Lists of primers for PCR and site directed mutation

1.4 表達(dá)載體的巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化和篩選

巴斯德畢赤酵母GS115 電穿孔法感受態(tài)細(xì)胞制備后，冰上放置，用于酵母轉(zhuǎn)化。表達(dá)載體質(zhì)粒經(jīng)過(guò)Sac I 線性化后進(jìn)行巴斯德畢赤酵母電轉(zhuǎn)化。儀器采用MicroPulserElectroporator 電轉(zhuǎn)化儀（美國(guó)伯樂(lè)），選擇真菌默認(rèn)參數(shù)。轉(zhuǎn)化后向細(xì)胞懸液加入1 mL 1 mol/L 山梨醇溶液，利用MD 平板在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 篩選。pPIC9K 載體作為陰性對(duì)照。對(duì)MD 平板篩選到的轉(zhuǎn)化子，用不同質(zhì)量濃度（1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL）G418 遺傳霉素的YPD 平板進(jìn)一步篩選，以獲得含多拷貝基因轉(zhuǎn)化子。含100 μg/mL 羅丹明B 的BMMY 平板用于脂肪酶活性菌株的篩選，選擇紫外光下具有較大熒光圈的菌株，用于后續(xù)脂肪酶的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測(cè)。

1.5 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)和脂肪酶酶活測(cè)定

重組菌株接種于BMGY 培養(yǎng)基，28 ℃轉(zhuǎn)速250 r/min 搖床培養(yǎng)，到OD600為2.0～4.0 之間。離心收集細(xì)胞，用無(wú)菌生理鹽水清洗2 次，用100 mL BMMY 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)菌體OD600至1.0。28 ℃，250 r/min 甲醇為碳源培養(yǎng)并誘導(dǎo)菌體進(jìn)行脂肪酶表達(dá)，每隔24 h 取樣，同時(shí)補(bǔ)加甲醇維持甲醇體積分?jǐn)?shù)1.0%，酵母持續(xù)誘導(dǎo)發(fā)酵156 h。取樣發(fā)酵液離心，收集上清液作為粗酶液，用于蛋白和酶活檢測(cè)，脂肪酶酶活的測(cè)定方法采用對(duì)硝基苯棕櫚酸酯（pNPP）底物法[13]。

1.6 RML 蛋白檢測(cè)和性質(zhì)鑒定

誘導(dǎo)表達(dá)的胞外蛋白通過(guò)SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。凝膠分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，考馬斯亮藍(lán)R250 用于染色。酶的性質(zhì)鑒定中所有樣品脂肪酶濃度調(diào)整到100 U/mL。比較同種體系下，不同溫度（20～70 ℃）下pNPP 水解活性，鑒定該脂肪酶的最適溫度。脂肪酶熱穩(wěn)定性試驗(yàn)在不同處理溫度（40～70 ℃）下溫浴5 h，根據(jù)脂肪酶殘留水解酶活進(jìn)行鑒定。最適溫度和溫度穩(wěn)定性以百分?jǐn)?shù)形式表示。另外，采用薄層層析色譜分析重組RML 催化三油酸甘油酯的水解產(chǎn)物，鑒定其sn1-3 專一性。非位置專一性酶對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室分離的出芽短梗霉脂肪酶。

1.7 蛋白結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建及結(jié)構(gòu)分析

以PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)米黑根毛霉脂肪酶（PDB 3TGL）的晶體結(jié)構(gòu)為模板，同源模突變體的蛋白結(jié)構(gòu)，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用I-TASSER 方法（Iterative Threading ASSEmbly Refinement）[14]；蛋白突變體的穩(wěn)定性變化分析通過(guò)FoldX 計(jì)算氨基酸突變前、后ΔG 值（kcal/mol）變化[15]，計(jì)算5 次取最小ΔΔG 值，公式為：

公式（1）中，若ΔΔG 為負(fù)，表明勢(shì)能降低，突變體較野生型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；反之，表明勢(shì)能增加，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；絕對(duì)值表明結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變化程度。另外，脂肪酶蛋白糖基化位點(diǎn)通過(guò)GlycoMod 軟件（http：//web.expasy.org/glycomod/）預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作圖及可視化使用PyMOL 1.3.x 和VMD 軟件實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RML 脂肪酶基因克隆、表達(dá)載體構(gòu)建

RML 優(yōu)化后的基因序列見(jiàn)圖1。表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115 菌株，先后經(jīng)MD 平板篩選、G418 平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子和含橄欖油-羅丹明B 的平板功能鑒定，得到具有較大熒光圈的菌株GS-coRML（+編號(hào)）作為后續(xù)研究。

圖1 coRML 和wtRML 序列比較分析Fig.1 Sequence comparison of coRML and wtRML

2.2 RML 脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)

RML 轉(zhuǎn)化子菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá) （圖2），重組菌株對(duì)甲醇的適應(yīng)較快，細(xì)胞在短暫的滯后期后迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)期，水解酶活也隨之緩慢上升，直到發(fā)酵156 h 達(dá)到3.77 U/mL，表達(dá)量明顯低于許多脂肪酶的巴斯德畢赤酵母重組表達(dá)量，表明不同基因?qū)Ρ磉_(dá)水平影響較大。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示（圖3），巴斯德畢赤酵母重組表達(dá)的RML 分子質(zhì)量在32 ku 和60 ku 有條帶，32 ku小于理論RML 脂肪酶前體分子質(zhì)量37.33 ku（含His Tag），為RML 成熟肽，60 ku 大于含前導(dǎo)肽RML 的理論分子質(zhì)量，RML 僅前導(dǎo)肽上有N 糖基化位點(diǎn)，表明重組脂肪酶有部分前導(dǎo)肽未能切開(kāi)，并且前導(dǎo)肽部分獲得了酵母宿主的翻譯后糖基化修飾。許多研究表明糖基化修飾對(duì)酵母中重組蛋白的分泌和積累有非常重要的作用[16-17]。N-糖基化修飾可提高蛋白穩(wěn)定性的可能原因包括：糖鏈能在一定程度上降低未折疊蛋白的無(wú)序度；另外，糖鏈為較大的親水基團(tuán)，有利于蛋白和水分子間氫鍵的形成，因而增加了蛋白的水溶性，并能抑制蛋白聚集和去折疊。

圖2 重組畢赤酵母的RML 生長(zhǎng)和酶活曲線Fig.2 Growth and lipase activity curve of RML transformant in the recombinant P.pastoris

圖3 重組畢赤酵母的RML 脂肪酶表達(dá)Fig.3 Analysis of RML expression in the recombinant P.pastoris

2.3 RML 溫度穩(wěn)定性、最適溫度測(cè)定

最適溫度試驗(yàn)表明（圖4a），RML 脂肪酶的最適溫度為45 ℃，當(dāng)溫度高于和低于這一溫度時(shí)，酶活都顯著降低，呈現(xiàn)倒V 形，表明RML 酶活對(duì)溫度較為敏感。另外，RML 脂肪酶的溫度穩(wěn)定性較為一般（圖4b），40 ℃處理5 h 仍然能保持基本不變。令人奇怪的是RML 在40 ℃處理有助于酶活的提升，表明最適酶活溫度處理可能起到激活脂肪酶的效果。然而，當(dāng)處理溫度高于40 ℃（50，60，70 ℃）時(shí)，酶活均下降明顯，表明RML 脂肪酶的最適酶活只能達(dá)到45 ℃，可能是RML 不太理想的熱穩(wěn)定性所致。

2.4 RML Kex2 酶切位點(diǎn)改造

為了進(jìn)一步改善RML 脂肪酶的重組表達(dá)，本試驗(yàn)通過(guò)定點(diǎn)突變的方式去掉潛在的Kex2 酶切位點(diǎn) （成熟肽196 和197 氨基酸殘基 “-Arg-Arg-”）。通過(guò)RML 同源序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Arg197殘基非常保守，因此僅對(duì)Arg196 殘基進(jìn)行改造，參考同源序列，將Arg196 殘基（全序列第291 位）突變?yōu)镚ln、His 和Ser，從而獲得突變體RMQ、RMH 和RMS。經(jīng)FoldX 軟件分析，RMQ、RMH 和RMS 較野生型RML 脂肪酶蛋白的最低ΔΔG 值分別為0.06，0.46，2.05 kcal/mol，穩(wěn)定性較野生型均有所降低。

經(jīng)4 mg/mL G418 平板篩選高拷貝后，從羅丹明B 篩選平板選出GS-RMQ、GS-RMH 和GSRMS 各4 株具有較大熒光圈的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵誘導(dǎo)168 h 后測(cè)定胞外酶活，比較平均酶活，結(jié)果見(jiàn)圖5所示，RML 突變體酶活均顯著低于野生型的RML 脂肪酶，且SDS-PAGE 結(jié)果表明蛋白表達(dá)量都很低。結(jié)果表明“-Arg196-Arg197-”序列并不影響RML 的重組表達(dá)。通過(guò)對(duì)RML 蛋白結(jié)構(gòu)分析，“-Arg196-Arg197-”位于脂肪酶的β折疊上，Arg196 的部分支鏈位于蛋白表面，而Arg197 殘基以及二者形成的肽鍵，即Kex2 酶切位點(diǎn)的肽鍵被包埋在蛋白的內(nèi)部（圖6）。因此，包埋在蛋白的內(nèi)部Kex2 潛在酶切位點(diǎn) “-Arg196-Arg197-”并不會(huì)裂解RML 蛋白和影響其表達(dá)，同時(shí)表明畢赤酵母Kex2 的酶切修飾過(guò)程發(fā)生在脂肪酶結(jié)構(gòu)基本折疊完成之后。

圖4 重組RML 的最適溫度（a）和溫度穩(wěn)定性（b）測(cè)定Fig.4 Effect of temperature on RML lipase activity （a） and stability （b）

圖5 RML 和其突變體菌株胞外酶活比較Fig.5 Extracellular lipase activity of RML and its variants strains

圖6 RML 脂肪酶Arg-Arg 所處位置Fig.6 Position of Arg196-Arg197 in the RML structure

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)RML 的表達(dá)量較許多脂肪酶的巴斯德畢赤酵母重組表達(dá)明顯偏低，平均水解酶活僅為3.77 U/mL，有必要對(duì)其重組表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。為進(jìn)一步改善RML 脂肪酶的重組表達(dá)，本試驗(yàn)通過(guò)定點(diǎn)突變的方式去掉潛在的Kex2 酶切位點(diǎn)（成熟肽196 和197 氨基酸殘基“-Arg-Arg-”）。結(jié)果顯示RML 突變體酶活均顯著低于野生型的RML 脂肪酶，且SDS-PAGE 結(jié)果表明蛋白表達(dá)量都很低。由此可見(jiàn)，“-Arg196-Arg197-”序列并不影響RML 的重組表達(dá)。通過(guò)對(duì)RML 蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Kex2 酶切位點(diǎn)的肽鍵被包埋在蛋白的內(nèi)部。

另外，分析兩種脂肪酶以及畢赤酵母的氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，RML 蛋白中具有較高比例的脯氨酸殘基Pro，在先導(dǎo)肽70 氨基酸殘基中含11 個(gè)Pro殘基，在成熟蛋白區(qū)域有13 個(gè)Pro 殘基，RML 先導(dǎo)肽、成熟蛋白和前體蛋白的大小分別為70，269和339 氨基酸殘基，其中Pro 殘基的摩爾比例分別達(dá)到14.3%，4.8%和7.1%。而畢赤酵母中Pro 出現(xiàn)的頻率為4.5%，提示先導(dǎo)肽中Proline 對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的意義。由于Pro 的順?lè)串悩?gòu)化是蛋白質(zhì)折疊的重要限速步驟之一[18]，如何能使目標(biāo)蛋白大量表達(dá)的同時(shí)，保證RML 前體中Pro 殘基的正確折疊是后續(xù)需要解決的問(wèn)題。