黃曲霉毒素M1與赭曲霉毒素A聯(lián)合作用誘導(dǎo)分化Caco-2細(xì)胞凋亡的機(jī)制

張 煥 高亞男 鄭 楠 王加啟 任 輝*

（1 吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長春130022 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100193 3 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京）北京100193）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFs）是寄生曲霉和黑曲霉等曲霉菌屬的次生代謝產(chǎn)物[1]，包括黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）和黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）。干旱、高溫、存儲(chǔ)時(shí)間和條件等自然環(huán)境會(huì)影響霉菌的生長和AFs的產(chǎn)生[2]。其中AFB1的毒性最強(qiáng)，具有致癌、致畸、致突變的作用[3]，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為I 類致癌物[4]。哺乳動(dòng)物攝入被AFB1污染的飼料或食品后，通過羥基化作用將AFB1轉(zhuǎn)化成黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）[5]。AFB1在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程如圖1所示[6]。AFM1熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。Oruc 等[7]對(duì)奶和奶制品中黃曲霉毒素的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在奶酪存儲(chǔ)期間黃曲霉毒素穩(wěn)定性強(qiáng)，AFB1能在傳統(tǒng)奶酪中保持活性90 d 以上。

赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是由多種曲霉和青霉菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物[8]，廣泛存在于谷物和肉類等食品和飼料中[9]。其殘留在動(dòng)物體內(nèi)具有腎毒性和免疫毒性，引發(fā)癌變畸變[10-11]。然而，沒有確切的證據(jù)能夠證實(shí)OTA 導(dǎo)致腎病和癌癥的發(fā)生[12]，其與腸道上皮細(xì)胞的相互作用的研究也較少[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，高濃度的OTA 導(dǎo)致大鼠、狗、豬和雞腸黏膜損傷[14]，改變腸道細(xì)胞膜通透性，引起快速炎癥反應(yīng)，引發(fā)胃腸道功能紊亂，腹瀉，嘔吐和營養(yǎng)不良等癥狀[15-16]。OTA 與AFM1毒性相當(dāng)，同樣存在于牛奶中，研究OTA 與AFM1聯(lián)合作用，對(duì)于奶制品中霉菌毒素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作具有重要意義。

圖1 肝臟中黃曲霉毒素的轉(zhuǎn)化Fig.1 Aflatoxin B1 metabolism in liver

作為抵御食品污染的第一道屏障，腸道上皮細(xì)胞對(duì)霉菌毒素具有高度敏感性[17]。其中體外培養(yǎng)分化的Caco-2 細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能類似于人體真實(shí)小腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，其具有微絨毛等結(jié)構(gòu)，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系，具有相同的細(xì)胞極性和緊密連接[18]。James 等[19]以未分化Caco-2 細(xì)胞為體外模型，研究多種霉菌毒素的交互作用，如DON 和ZEA 聯(lián)合作用可促進(jìn)細(xì)胞丙二醛（malondialdehyde，MDA）的產(chǎn)生，引起細(xì)胞氧化DNA 損傷，且兩種霉菌毒素聯(lián)合后比單獨(dú)作用毒性更強(qiáng)。飼料及其原料中往往含多種霉菌毒素，一種霉菌也可產(chǎn)生多種毒素，因此食品中往往存在多種霉菌毒素共存的情況。

細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）家族活化、DNA 損傷、蛋白交聯(lián)、線粒體膜電位改變等[20]。引發(fā)細(xì)胞凋亡主要通過兩條途徑[21]：一條為體外路線，即死亡受體通路；另一條為體內(nèi)途徑，即線粒體通路。線粒體途徑又稱內(nèi)源途徑，一般由細(xì)胞內(nèi)信號(hào)引發(fā)，通過作用Bcl-2 蛋白家族改變線粒體膜結(jié)構(gòu)，使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，釋放促凋亡物質(zhì)，如細(xì)胞色素C、半胱氨酸蛋白酶激活劑（Smac/DIABLO）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）及核酸內(nèi)切酶G、絲氨酸蛋白酶（HtrA2/Omi）等。本文通過研究AFM1和OTA 單一及聯(lián)合作用對(duì)Caco-2 細(xì)胞凋亡的影響，判斷作用機(jī)制，為牛奶質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及試驗(yàn)試劑 人的結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2），購自美國ATCC 公司；黃曲霉毒素M1 標(biāo)準(zhǔn)品，百靈威科技有限公司；OTA 標(biāo)準(zhǔn)品，美國Fermentek 公司；DMEM 培養(yǎng)基，美國Gibco 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），美國Gibco 公司；非必須氨基酸 （nonessential amino acid，NEAA），美國Macgene 公司；雙抗，碧云天生物技術(shù)研究所；二甲基亞砜（dimethylsulphoxide，DMSO），美國Sigma 公司；PBS，碧云天生物技術(shù)研究所；胰酶，碧云天生物技術(shù)研究所；DCFH-DA，美國Sigma 公司；細(xì)胞凋亡試劑盒，美國BD 公司；線粒體膜電位試劑盒，碧云天生物；Alamar-Blue，美國Sigma 公司；細(xì)胞凋亡蛋白抗體Caspase-3 和caspase-9 抗體，美國Cell signaling technology 公司等。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 冷凍離心機(jī)SK15，美國Sigma；恒溫CO2培養(yǎng)箱3111，美國Thermo；倒置顯微鏡IX71，日本Olympus；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀506BR1544，美國Bio-Rad TC10；酶標(biāo)儀AMR-100，美國Thermo；Beckman Altra 流 式 細(xì) 胞 儀，美 國Thermo；SDS-PAGE 電泳儀JP300C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；轉(zhuǎn)膜儀IB21001，美國生命技術(shù)公司；搖床WSZ-20A，上海一恒科技有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Caco-2 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，加入10%的胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液（1%非必須氨基酸、0.1%青霉素和鏈霉素）在5% CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每3 天傳代一次。培養(yǎng)分化細(xì)胞是將消化下來的細(xì)胞懸浮液用細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)，用完全培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度稀釋至3×104個(gè)/mL，向12 孔Transwell 板的頂端絨毛面加入0.5 mL 稀釋過的細(xì)胞懸浮液，底端基底面加入1.5 mL 完全培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻，放入5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 天換液一次，直至第21 天。試驗(yàn)所用的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，后續(xù)所有試驗(yàn)采用的均為培養(yǎng)21 d 分化的Caco-2 細(xì)胞。

毒素處理細(xì)胞。固體毒素用甲醇溶解之后溶解在無血清的培養(yǎng)基中，分別設(shè)計(jì)空白對(duì)照組、單獨(dú)AFM1組、單獨(dú)OTA 組、AFM1和OTA 聯(lián)合作用4 組試驗(yàn)，放入5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.2 細(xì)胞存活率測(cè)定 Alamar-Blue 法檢測(cè)分化的Caco-2 細(xì)胞存活率，細(xì)胞于24 孔板中培養(yǎng)成分化狀態(tài)后，移去上層培養(yǎng)液，用PBS 清洗2～3次，處理組加入含有不同濃度不同種類毒素的處理液，對(duì)照組加入100 μL 不含毒素完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后吸去培養(yǎng)液，每孔中加入1 mL 含10% Alamar-Blue 溶液的培養(yǎng)基，37 ℃條件下過夜培養(yǎng)，活細(xì)胞將Alamar-Blue 氧化藍(lán)色轉(zhuǎn)化成粉色形式，用酶標(biāo)儀在570 nm 處（以630 nm 為參考波長）測(cè)定吸光度值。試驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)算公式如下[22]。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長期分化的Caco-2 細(xì)胞，毒素處理24 h 后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 洗滌細(xì)胞1 次，加入適量0.25%不含EDTA 的胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。吸除胰酶細(xì)胞消化液。加入收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)，在流氏細(xì)胞儀上檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 細(xì)胞活性氧釋放量檢測(cè) 用PBS 溶液將毒素處理過的樣品稀釋為1×107cells/mL 的細(xì)胞懸液，加入 20 μmol/L 活性氧熒光探針carboxy-H2DCFDA（Eugene，OR），在30 ℃條件下孵育30 min；使用PBS 洗滌2 次，并通過酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度（488 nm 激發(fā)波長，525 nm 發(fā)射波長），按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.5 線粒體膜電位 （mitochondrial membrane potential，MMP）檢測(cè) 用六孔板培養(yǎng)Caco-2 細(xì)胞，分化完成時(shí)，用毒素處理24 h 后，用PBS 洗滌細(xì)胞，每孔加入1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液和1 mL JC-1染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次。每孔加入2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，按照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）說明在熒光顯微鏡下觀察測(cè)定。通常情況下，當(dāng)線粒體的膜電位會(huì)完全喪失時(shí)，JC-1 染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-1 染色后應(yīng)顯示紅色熒光。熒光強(qiáng)度越大，線粒體膜電位越高。

1.2.6 線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 提取細(xì)胞總蛋白，95 ℃變性5 min，將樣本在30%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離電泳（80 V，2.5 h），將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜（60 V，2 h）。將載有蛋白質(zhì)的PVDF 膜在封閉液中封閉1 h，分別與抗Caspase-3 和caspase-9 抗體 （1 ∶1 000）4 ℃作用過夜，用0.1%Triton-PBS 溶液漂洗3 次，每次10 min，與相應(yīng)二抗（1 ∶1 000）常溫下作用1 h，0.1% Triton-PBS 溶液漂洗3 次，每次10 min。漂洗后化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒顯色，在凝膠成像系統(tǒng)將膠片曝光、顯影、定影。免疫印跡條帶用Alpha View SA 軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用SAS9.2 軟件來分析，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。顯著性用P 值表示，P<0.05 為顯著。判斷交互作用類型參照Clarke 等[23]描述方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFM1 和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化Caco-2 細(xì)胞活性的影響

Alamar-Blue 法檢測(cè)AFM1和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化的Caco-2 細(xì)胞存活率的影響如圖2所示，由圖可見，與對(duì)照組相比，AFM1 和OTA對(duì)細(xì)胞的生長具有抑制作用，且OTA 對(duì)細(xì)胞的抑制作用比AFM1更強(qiáng)，分別為95.59%±13.58%和93.14%±8.63%，兩者聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞生長抑制作用加強(qiáng)，為81.57%±12.74%，參照Clarke 等[23]描述判斷交互作用類型數(shù)據(jù)分析方法，單獨(dú)AFM1與OTA 之和減去100 所得數(shù)值即為AFM1和OTA 聯(lián)合作用的預(yù)測(cè)值，試驗(yàn)中得到的AFM1和OTA 聯(lián)合作用的真實(shí)值低于預(yù)測(cè)值，可以判斷AFM1和OTA 聯(lián)合作用時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率具有協(xié)同作用。

2.2 AFM1 和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化Caco-2 細(xì)胞凋亡的影響

圖2 AFM1 和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化Caco-2 細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of AFM1 and OTA alone and in combination on the survival rate of differentiated Caco-2 cells

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序性死亡，對(duì)維持機(jī)體胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要作用。Annexin V 為一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，Annexin V 用熒光素FITC 標(biāo)記后，可以用來檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙錠（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，然而能夠穿透凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞的破損細(xì)胞膜，并使細(xì)胞核染色。將Annexin V 和PI 匹配使用，就可區(qū)分處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。圖3中B1 代表壞死細(xì)胞，B2 代表細(xì)胞凋亡早期，B3 代表細(xì)胞凋亡晚期，B4 代表存活細(xì)胞。由圖可以看出，單獨(dú)AFM1和單獨(dú)OTA 都能夠誘導(dǎo)分化Caco-2 細(xì)胞凋亡，當(dāng)12 μmol/L AFM1作用于分化的Caco-2 細(xì)胞時(shí)，凋亡率為25.68%，壞死率為3.35%；當(dāng)6 μmol/L OTA 作用于分化的Caco-2細(xì)胞時(shí)，凋亡率為33.7%，壞死率為2.53%；當(dāng)AFM1和OTA 同時(shí)作用于分化的Caco-2 細(xì)胞時(shí)，凋亡率為37.4%，壞死率為3.99%。AFM1和OTA聯(lián)合作用的死亡率大于任何一種單獨(dú)作用的作用效果，因此AFM1 和OTA 聯(lián)合作用能夠增加細(xì)胞死亡率，并且能夠增強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖3 AFM1 和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化Caco-2 細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of single and combined AFM1 and OTA on apoptosis rate of differentiated Caco-2 cells

2.3 AFM1 和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化Caco-2 細(xì)胞活性氧釋放量的影響

線粒體使ROS 產(chǎn)生的重要場(chǎng)所，線粒體通透性孔道的開放釋放出大量活性氧，這些活性氧又能夠進(jìn)一步激活該孔道，以正反饋的形式進(jìn)一步加劇孔道的打開，放大凋亡信號(hào)。低濃度的ROS具有有益的生理功能，高濃度的ROS 具有有害的病理功能，可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，一方面影響亞細(xì)胞器的功能，通過改變線粒體膜的通透性而引起線粒體的損傷，另一方面直接作用于蛋白質(zhì)、脂類和DNA，造成氧化損傷，引起癌癥、糖尿病、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和衰老等。由圖4可以看出，AFM1 和OTA 作用于分化Caco-2 細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，細(xì)胞ROS 生成增多，空白組熒光強(qiáng)度較弱，ROS 生成少，AFM1單獨(dú)作用是對(duì)照組的1.37 倍，OTA 單獨(dú)作用是對(duì)照組的1.79 倍；AFM1和OTA 聯(lián)合作用ROS 的釋放量顯著增多，是對(duì)照組的6.21 倍?；钚匝醯纳煽蓪?duì)細(xì)胞造成氧化應(yīng)激反應(yīng)，活性氧從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，對(duì)線粒體電位產(chǎn)生影響，激活凋亡蛋白的表達(dá)。

圖4 AFM1 和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化Caco-2細(xì)胞活性氧釋放量的影響Fig.4 Effect of single and combined AFM1 and OTA on reactive oxygen release of differentiated Caco-2 cells

2.4 AFM1 和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化Caco-2 細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖5 AFM1 和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化Caco-2 細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.5 Mitochondrial membrane of differentiated Caco-2 cells treated with single and combined AFM1 and OTA for 24 h by JC-1

線粒體的膜通透性轉(zhuǎn)換現(xiàn)象主要是指線粒體內(nèi)膜的非特異的通透性變大，促使線粒體基質(zhì)的蛋白濃度高于線粒體內(nèi)外膜間隙及胞漿內(nèi)的蛋白濃度，膠體滲透壓導(dǎo)致線粒體腫脹，表現(xiàn)出線粒體膜電位發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)線粒體腫脹。AFM1和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化Caco-2 細(xì)胞線粒體膜電位的影響如圖5所示，a 圖對(duì)照組中，熒光顯微鏡下觀測(cè)到細(xì)胞膜電位基本正常，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入AFM1或OTA 后，代表線粒體膜電位的紅綠光比值逐漸降低，說明AFM1和OTA 處理細(xì)胞后引起細(xì)胞線粒體膜電位的下降和膜通透性增加。當(dāng)同時(shí)加入AFM1和OTA 時(shí)，熒光顯微鏡下已基本呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降，膜通透性顯著增加。由此說明AFM1和OTA 聯(lián)合作用可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)分化Caco-2 細(xì)胞凋亡。

2.5 AFM1 和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化的Caco-2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

在細(xì)胞凋亡的晚期，由于線粒體和胞漿中的抗氧化系統(tǒng)紊亂，產(chǎn)生的ROS 無法得到有效的清除，細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平會(huì)顯著升，高濃度的ROS會(huì)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，造成氧化損傷，導(dǎo)致線粒體功能的喪失，并最終引發(fā)細(xì)胞凋亡，凋亡效應(yīng)分子caspase-3 位于凋亡通路樞紐地位，caspase-3活化能引起細(xì)胞凋亡。caspase-3 的活化主要依靠caspase-9 的激活，試驗(yàn)中分別檢測(cè)凋亡蛋白caspase-3 和caspase-9 表達(dá)量變化，由圖6可以看出，AFM1 和OTA 單獨(dú)作用都可以促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)量增加，caspase-3 蛋白結(jié)果具有顯著性；AFM1 和OTA 聯(lián)合作用與單獨(dú)作用組相比，凋亡蛋白caspase-3 和caspase-9 表達(dá)量均變高，由Clarke 法數(shù)據(jù)分析可知，AFM1 和OTA 聯(lián)合作用對(duì)caspase-3 凋亡蛋白的表達(dá)具有拮抗作用，對(duì)caspase-9 凋亡蛋白的表達(dá)具有協(xié)同作用，在此劑量條件下，由此說明霉菌毒素作用細(xì)胞方式不一致，促進(jìn)細(xì)胞凋亡方式也不同。

以上結(jié)果可以得出，AFM1和OTA 促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能由于AFM1和OTA 促進(jìn)細(xì)胞活性氧產(chǎn)生，活性氧進(jìn)入線粒體后，改變細(xì)胞膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素C 生成，細(xì)胞色素C 由線粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，激活凋亡蛋白產(chǎn)生，最后引起細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這也說明了氧化損傷是細(xì)胞凋亡機(jī)制之一。

3 討論

圖6 AFM1 和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)分化的Caco-2 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of single and combined AFM1 and OTA on the expression of apoptosis protein of differentiated Caco-2 cells

霉菌毒素可以增加動(dòng)物體重和相關(guān)臟器質(zhì)量，引起腸胃功能紊亂，導(dǎo)致腹瀉、食欲減退、肝腫大，造成腸道上皮細(xì)胞凋亡[24]。Zhang 等[25]研究表明，AFM1降低分化和未分化Caco-2 細(xì)胞存活率，對(duì)細(xì)胞造成氧化DNA 損傷。Maresca 等[26]研究發(fā)現(xiàn)OTA 能夠改變腸道的吸收功能。OTA 能夠引起Caco-2 和HepG-2 共培養(yǎng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[27]。本試驗(yàn)以分化Caco-2 細(xì)胞為體外模型，研究AFM1和OTA 兩種霉菌毒素單獨(dú)和聯(lián)合作用。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞受到毒素刺激后，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降伴隨著ATP 水平下降[28]，同時(shí)線粒體是活性氧產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，又是活性氧作用最敏感的部位，活性氧會(huì)對(duì)線粒體造成氧化損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，AFM1和OTA 顯著抑制分化Caco-2 生長、增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞特征，AFM1和OTA 聯(lián)合作用毒性效果增加。AFM1和OTA 增加細(xì)胞ROS 釋放量，ROS以細(xì)胞線粒體為靶點(diǎn)，攻擊線粒體，降低膜電位[30]，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AFM1 和OTA 聯(lián)合作用與單獨(dú)作用相比，細(xì)胞ROS 釋放量顯著增加。AFM1和OTA 進(jìn)入細(xì)胞后激發(fā)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 表達(dá)，從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡，這說明AFM1和OTA 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究盡管是體外細(xì)胞試驗(yàn)，隨著對(duì)AFM1和OTA 單獨(dú)及聯(lián)合作用及其機(jī)制的深入研究，進(jìn)一步揭示霉菌毒素對(duì)人體毒性作用機(jī)理，為深入研究多種霉菌毒素在體內(nèi)對(duì)人體腸道功能的影響，將對(duì)于制定霉菌毒素在食品中的限量標(biāo)準(zhǔn)及開發(fā)生物技術(shù)對(duì)食品及原料中的霉菌毒素的控制將具有重要意義。

對(duì)于食品中真菌毒素的最大允許量，國家有明確的規(guī)定[31]，但規(guī)定中沒有提及兩種以上的真菌毒素共同存在時(shí)的限量標(biāo)準(zhǔn)，所以當(dāng)兩種以上毒素共存時(shí)，其含量分別符合限量標(biāo)準(zhǔn)，但如果聯(lián)合加和或協(xié)同作用，則會(huì)對(duì)人體造成更大傷害。因此，通過研究食品中常見的真菌毒素共存時(shí)的聯(lián)合作用，可為食品安全提供更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。