豆腐加工廢水發(fā)酵物的抑菌作用

陳躍文 王怡然 陳 錚 朱 炫 陳 杰 崇云青 陳 怡 劉飛建

（1 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018 2 浙江工商大學(xué) 國家級食品工程與質(zhì)量安全實驗教學(xué)中心 杭州310018 3 中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會 北京100048）

豆腐是中國的傳統(tǒng)食品，因營養(yǎng)豐富，故易滋生各種微生物而不易存放，導(dǎo)致豆腐產(chǎn)量無法提升及后續(xù)加工衛(wèi)生狀況無法改善。研究豆腐保鮮技術(shù)，延長豆腐保質(zhì)期，緩解豆腐儲存運輸壓力，有利于提高經(jīng)濟效益。目前，有人利用高壓滅菌法和加壓蒸煮法以及無菌充填法等來延長豆腐保質(zhì)期，然而，這些方法可能改變豆腐風(fēng)味，使豆腐的品質(zhì)下降。

浙江省的大豆制品廠在生產(chǎn)過程中，各股黃水量和濃度隨著生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品類別、生產(chǎn)習(xí)慣等不同而不同。我國的豆腐產(chǎn)量大，每天均有大量豆腐黃水排出。由豆腐生產(chǎn)而排放的大量廢水中有機物污染物濃度高，每生產(chǎn)1t 豆腐，就會產(chǎn)生至少10 t 的廢水，而廢水的COD 值極高，超過2 000 mg/L，對環(huán)境污染極大。這種黃水一般經(jīng)過簡單處理之后直接排放到下水道中，對水環(huán)境污染嚴(yán)重，目前還沒有專業(yè)化處理技術(shù)。豆腐廢水處理一直是豆腐生產(chǎn)行業(yè)面臨的難題。

豆腐黃水中含還原糖1.2～1.3 g/L，總糖5.2～8.0 g/L，總氮0.7～0.8 g/L[1]，這些成分可以為微生物的生長提供營養(yǎng)支持，因此可用于培養(yǎng)微生物。

基于以上幾點，利用豆腐廢水中含有的單糖、寡聚糖、鉀、磷、鈣、鐵、維生素、有機酸、水溶性蛋白、氨基酸和脂類等營養(yǎng)成分[2]進行微生物的培養(yǎng)，通過微生物發(fā)酵的方法得到抑菌物質(zhì)，再將發(fā)酵產(chǎn)物反加回豆腐中，這種方法不僅可以很好地解決黃水排放的問題，而且在保證豆腐風(fēng)味的同時解決了豆腐保質(zhì)期短的問題，實現(xiàn)了環(huán)境和經(jīng)濟的雙贏[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 丙酸菌（Propionibacterium shermannii，PS）、 費氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii，PF）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri，LR）、大腸埃希氏菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus）。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）LB 固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，瓊脂15.0 g/L。

2）LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L。

3）MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，醋酸鈉5.0 g/L，檸檬酸銨2.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1.0 g/L。

4）平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g/L，酵母浸粉2.5 g/L，葡萄糖1.0 g/L，瓊脂15.5 g/L。

5）LB 半固培養(yǎng)基為LB 液體培養(yǎng)基另加入瓊脂7.5 g/L。

配制好的培養(yǎng)基121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 純凈工作臺SW-CJ-2FD，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（BSC-250）；自動高壓滅菌器（TOMY SX-500）；離心機；pH 計；血球計數(shù)板；顯微鏡；分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 豆腐黃水發(fā)酵試驗 取出豆腐黃水分別盛放于3 個錐形瓶中，高溫蒸汽滅菌鍋中121 ℃條件下滅菌15 min。

用血球計數(shù)板計算PS、PF、LR 的數(shù)量級。根據(jù)發(fā)酵菌數(shù)量級分別向滅菌后冷卻至45 ℃左右的黃水中接入PS、PF、LR。PS、PF 接種液在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，LR 接種液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每天取樣（上清和全液），用于抑菌試驗[4]。

1.2.2 豆腐黃水發(fā)酵優(yōu)化試驗 在接種發(fā)酵菌的同時，PS，PF 接種液中添加10%的葡萄糖，LR 接種液中加入比例為1∶3 的葡萄糖∶甘油，其余均同

1.2.1 節(jié)豆腐黃水發(fā)酵試驗。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物抑菌試驗 滅菌后的LB 半固培養(yǎng)基接入指示菌，倒平板，待培養(yǎng)基凝固后用打孔器在培養(yǎng)基上打孔，放入4 ℃冰箱中冷藏半小時，取出，向圈中加入200 μL 抑菌劑，放入4 ℃冰箱中冷藏3 h，取出后放進37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h[5-6]。12 h 后取出培養(yǎng)皿，拍照并測量抑菌圈大小，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 豆腐保質(zhì)期試驗 市售新鮮豆腐切成大小為2 cm×2 cm 的塊狀若干，噴灑抑菌劑，并設(shè)置1組空白對照。室溫培養(yǎng)[8]。

1.2.5 抑菌劑穩(wěn)定性試驗 每天用平板計數(shù)法測定抑菌劑在室溫中抑制豆腐其他微生物的情況，通過比較空白的菌落數(shù)測定其是否還穩(wěn)定存在。并取樣測定豆腐pH 值，觀察豆腐風(fēng)味變化。

1.2.6 抑菌劑在豆腐中抑菌效果 將豆腐中常見的大腸埃希氏菌 （E.coli）、 金黃色葡萄球菌（S.aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus）作為指示菌每天加入室溫放置的豆腐中，用平板計數(shù)法測定抑菌劑隨時間的增加，抑制指示菌的效果。取樣測定豆腐pH 值[9]。

1.2.7 豆腐黃水發(fā)酵產(chǎn)物高產(chǎn)試驗 通過改變發(fā)酵條件（微生物接種量，黃水pH、碳源含量），得到最適發(fā)酵條件[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆腐黃水發(fā)酵試驗及優(yōu)化試驗理化指標(biāo)

PS、PF、LR 3 種微生物在豆腐黃水中發(fā)酵4d，每天測量3 種菌的菌液的pH 及OD 值，結(jié)果見表1[12]。從表1中可知3 種微生物優(yōu)化與未優(yōu)化的菌液的pH 值和OD 值均有一定程度的增大[13]。

表1 豆腐黃水發(fā)酵試驗及優(yōu)化試驗pH 與OD 值Table 1 The pH and OD in the fermentation experiments and optimization of the experiments with tofu waste water

（續(xù)表1）

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物抑菌試驗

2.2.1 指示菌活均數(shù) 從-80 ℃中取出的3 種指示菌活化擴培1 d 后，用血球計數(shù)板測量活菌數(shù)，結(jié)果見圖1。據(jù)圖可知，抑菌試驗中為保持3 種指示菌同一數(shù)量級，大腸埃希氏菌需稀釋5 倍，與金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌基本一致[16-17]。

2.2.2 抑菌試驗結(jié)果 從表2可知，優(yōu)化試驗組的抑菌效果普遍好于未優(yōu)化的試驗組。其中，對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好的是發(fā)酵第2 天的LR 優(yōu)菌液與PF 優(yōu)的清液；對大腸埃希氏菌抑菌效果最好的是發(fā)酵第2 天的PS 優(yōu)菌液與PS 優(yōu)清液；對Bacillus 抑菌效果最佳的是發(fā)酵第2 天的PS 優(yōu)菌液與LR 優(yōu)清液。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)發(fā)酵第2天的PS 優(yōu)菌液是所有試驗組中抑菌效果最好的一組[20-21]。

圖1 指示菌活菌數(shù)Fig.1 The number of live indicator bacteria

表2 抑菌劑抑菌試驗抑菌圈直徑Table 2 The circle diameter of inhibiting bacteriostatic experiment

2.3 豆腐保質(zhì)期試驗結(jié)果

2.3.1 抑菌劑回加豆腐pH 值 豆腐中主要的致病菌為枯草芽孢桿菌，因此我們選擇將發(fā)酵2 d的PS 優(yōu)菌液與LR 優(yōu)清液回加入到豆腐中，室溫放置3 d[18-19]，測定每天的pH 值（表3）可知pH 均明顯增大，而到第3 天時pH 大部分超過7，因此可以基本斷定抑菌劑活性消失。

2.3.2 抑菌劑回加豆腐抗菌性結(jié)果 由表4可知，通過豆腐黃水發(fā)酵制得的抑菌劑回加入豆腐后，LR 優(yōu)清與PS 菌液均有較好的抗菌效果，無論是對空氣中其他微生物的抑菌作用還是當(dāng)加入枯草芽孢桿菌作為指示菌時，PS 菌液抑菌效果均優(yōu)于LR 清液。穩(wěn)定性試驗與抑菌效果試驗中，第3天的抑菌效果較第2 天并沒有明顯減弱，甚至進一步加強。加入抑菌劑的豆腐其保質(zhì)期相對市售豆腐保質(zhì)期延長了2 d。

表3 抑菌劑回加豆腐3 d pH 值Table 3 Bacteriostatic agent to add tofu pH for three day

表4 抑菌劑回加豆腐平板菌落數(shù)Table 4 Bacteriostatic agent to add tofu plate colony count

2.4 菌落總數(shù)與各品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析

豆腐在25 ℃下微生物指標(biāo)和理化指標(biāo)隨著貯藏時間的延長而不斷變化，由表5中pearson 相關(guān)系數(shù)可以確定各腐敗指標(biāo)之間的關(guān)系。當(dāng)P=0.05 時，各個指標(biāo)中菌落總數(shù)與pH 值極顯著相關(guān)，并且相關(guān)系數(shù)在0.85 以上，因此可以看出菌落總數(shù)是影響豆腐品質(zhì)的重要因素。

表5 豆腐在25 ℃下各品質(zhì)指標(biāo)的Pearson相關(guān)系數(shù) （P=0.05）Table 5 Pearon correlation coefficient of quality characteristics of tofu at 25 ℃（P=0.05）

3 結(jié)論

試驗前期，根據(jù)文獻查閱資料，優(yōu)化PS、PF、LR 3 種微生物的發(fā)酵條件，通過比較優(yōu)化試驗組與未優(yōu)化試驗組的理化指標(biāo)以及相應(yīng)的抑菌效果，初步斷定出優(yōu)化后發(fā)酵2 d 的PS 菌液對3 種指示菌具有較好的抑菌效果。后將抑菌劑噴灑至豆腐，無論是未加指示菌的組別還是加入了枯草芽孢桿菌作為指示菌的試驗組別，發(fā)現(xiàn)PS 菌液的抑菌效果優(yōu)于LR 清液。且豆腐加入抑菌劑后延長其保質(zhì)期2 d。因此優(yōu)化發(fā)酵2 d 的PS 菌液綜合考慮適合作為一種新型抑菌劑加入豆腐中。