丹參中三萜酸的分離及其抗炎活性的研究＊

黃莉婷，丁 昉，許瓊明，2，楊世林，2，高紅偉，3＊＊

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南寧 530020；2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院 蘇州 215123；3.廣西優(yōu)勢(shì)中成藥與民族藥開(kāi)發(fā)工程技術(shù)中心 南寧 530020）

丹參Radix Salviae Miltiorrhizae是唇形科植物丹參的干燥根和根莖，它的主產(chǎn)地主要是在江蘇、山東、安徽、四川，大多數(shù)為栽培品；在春、秋二季采挖，除去它的莖葉、泥沙、須根，曬干。丹參最開(kāi)始被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。它性微寒，味苦。歸心、肝經(jīng)，具有活血通絡(luò)、祛瘀止痛、涼血消癰、清除心煩等功效，常用于治療心絞痛、冠心病及胸腹刺痛、經(jīng)閉痛經(jīng)等癥，入藥歷史悠久。《本草綱目》中記載，丹參活血，通心包絡(luò)，治疝痛；《本經(jīng)》記載，丹參主治心腹邪氣，腸鳴幽幽如走水，寒熱積聚，破癥除瘕，止煩滿，益氣；《別錄》記載，丹參養(yǎng)血，去心腹痼疾結(jié)氣，腰脊強(qiáng)腳痹，除風(fēng)邪留熱，久服利人，具有“一味丹參，功同四物”的說(shuō)法[1,2]。丹參作為一種傳統(tǒng)中藥，長(zhǎng)期記載于《中國(guó)藥典》中，且成功被《美國(guó)藥典》收錄。丹參作為一個(gè)在臨床上被用了上千年的中藥，被開(kāi)發(fā)出很多產(chǎn)品，如復(fù)方丹參滴丸、丹參片、復(fù)方丹參片、復(fù)方丹參注射液、丹參舒心膠囊、丹參酮膠囊等，尤其是丹參復(fù)方滴丸是第一個(gè)進(jìn)入美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）臨床試驗(yàn)的復(fù)方中藥，具有十分重要的意義。

圖1 三萜酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式

早在20世紀(jì)30年代，就有國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)丹參的化學(xué)成分進(jìn)行了研究。丹參化學(xué)成分主要包括兩大類：一類是以丹參素（Propanoid acid）和丹酚酸（Salvianolic acid）為代表的水溶性成分，主要以丹酚酸A、B、C、D、E最為常見(jiàn)[3]。而且現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，這些丹酚酸化合物具有明顯的生物活性，尤其是丹酚酸B的生活性研究的最為廣泛且深入。其明顯具有抗心血管疾病[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]、治療糖尿病[6]、抗炎、抗氧化等藥理活性[7]。另一類是以丹參酮（Tanshinone）為代表的脂溶性成分[2,8,9]，主要以丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I、二氫丹參酮I 最為常見(jiàn)。藥理活性研究表明，丹參酮具有明顯的生物活性，主要表現(xiàn)在抗炎[10]、抗腫瘤[11]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[12]、治療心血管疾病[13]等。三萜類成分如莫里斯酸、烏蘇酸等在唇形科鼠尾草屬植物中早已被分離得到[14]。其藥理活性亦有很多報(bào)道，主要體現(xiàn)在三萜酸對(duì)抗氧化、抗菌、抗腫瘤等方面的生物活性[14]，對(duì)三萜酸抗炎活性研究報(bào)道很少。因此，本實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)丹參中三萜酸一類化學(xué)成分分離及其抗炎活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，我們分離得到7 個(gè)三萜酸（圖1），他們都屬于本植物首次分離得到?？寡谆钚匝芯勘砻鳎麄兌季哂辛己玫目寡谆钚?。

1 儀器與材料

1.1 儀器

半制備島津高效液相色譜儀（LC-20AB，SPD-20A，日本島津公司）；C18分析色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)kromasil公司）；CPA225D Sartotius電子天平（上海中殷醫(yī)療設(shè)備有限公司）；核磁共振儀（TMS 內(nèi)標(biāo)，Bruker AVANCE III600 型，德國(guó)布魯克公司）；中壓柱色譜（填料為ODS，瑞士Buchi公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；Biotek Synergy H1 酶標(biāo)儀（美國(guó)博騰公司）；梅特勒-托利多電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 材料

化學(xué)試劑（分析純及色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氘代試劑（德國(guó)Merck 公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek 公司）；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、Greiss 試劑（美國(guó)Sigma 公司）；胎牛血清（FBS）及高糖培養(yǎng)基（DMEM）（美國(guó)Gibco 公司）；TNF-α及IL-6 ELISA試劑盒（中國(guó)深圳欣博盛公司）；RAW264.7細(xì)胞（美國(guó)ATCC）。丹參藥材購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院李笑然教授鑒定為丹參，藥材標(biāo)本保存于蘇州大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室（No.20151009-1）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

將50 kg干燥丹參飲片用95%乙醇（100 L）加熱回流提取兩次，減壓濃縮至無(wú)醇味。分別用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮得到二氯甲烷部位濃縮液（5.2 kg），乙酸乙酯濃縮液（3.8 kg），正丁醇濃縮液（6.3 kg）。將二氯甲烷部位濃縮液（5.2 kg）經(jīng)減壓硅膠柱色譜（200-300目），石油醚-乙酸乙酯（9∶1，6∶1，3∶1，1∶1，0∶1）梯度洗脫得到五個(gè)部位Fr.1-Fr.5，合并Fr.3和Fr.4兩個(gè)部位。將合并的部分樣品用純甲醇溶解，用中壓色譜（MPLC）連接ODS 反相色譜柱分離，甲醇-水（1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1）梯度洗脫，并結(jié)合SephadexLH-20凝膠色譜及半制備高效液相色譜（HPLC）進(jìn)一步分離，分離得到化合物1（45.6 mg），2（52.9 mg），3（62.3 mg），4（42.6 mg），5（39.1 mg），6（26.1 mg），7（51.0 mg）。并且這7個(gè)化合物都是從該植物中首次分離得到。

2.2 Greiss試劑檢測(cè)化合物對(duì)NO釋放的影響

將RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清（FBS）高糖培養(yǎng)基（DMEM）中，放在含有5%CO2溫度為37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將2×104RAW264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞種在96 孔板中，然后將其培養(yǎng)在CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜，用不同濃度的化合物（60,30,15 μM）預(yù)處理細(xì)胞1 h后，加入LPS（1 μg·mL-1）共培養(yǎng)16 h，取上清液（80 μL）與Griess 試劑（80 μL）混合，在CO2培養(yǎng)箱避光孵育15 min，用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為540 nm檢測(cè)吸光度值。

2.3 ELISA方法檢測(cè)TNF-α和IL-6

將2×105RAW264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞種在24 孔板中，然后將其培養(yǎng)在CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜，用不同濃度的化合物（60，30，15 μM）預(yù)處理細(xì)胞1 h 后，加入LPS（1 μg·mL-1）共培養(yǎng)16 h，取上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)化合物對(duì)炎癥因子：腫瘤壞死因子（TNF-α）及白介素-6（IL-6）的釋放情況。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

應(yīng)用Graphpad Prism 6.0 軟件中的單因素方差分析（One way-ANOVA）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較分析，所有藥理實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無(wú)定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.96（1H，m，H-2），3.48（1H，m，H-3），5.28（1H，s，H-12），2.25（1H，d，J=11.4 Hz，H-18），0.97（3H，s，H-23），0.87（3H，s，H-24），0.77（3H，s，H-25），0.97（3H，s，H-26），1.17（3H，s，H-27），0.80（3H，s，H-29），0.88（3H，s，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：42.1（C-1），66.6（C-2），79.1（C-3），38.6（C-4），48.3（C-5），18.7（C-6），33.2（C-7），39.8（C-8），47.6（C-9），38.7（C-10），23.8（C-11），125.7（C-12），138.6（C-13），41.3（C-14），28.6（C-15），24.4（C-16），47.5（C-17），53.2（C-18），39.7（C-19），39.5（C-20），30.4（C-21），37.3（C-22），28.9（C-23），22.5（C-24），16.9（C-25），17.4（C-26），23.9（C-27），181.1（C-28），17.2（C-29），21.6（C-30）。其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定其為2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid[15]。

化合物2：白色無(wú)定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.45（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），4.26（1H，m，H-2），5.49（1H，br，s，H-12），1.28（3H，s，H-23），1.02（3H，s，H-24），1.06（3H，s，H-25），1.08（3H，s，H-26），0.98（3H，s，H-29）1.22（3H，s，H-27），0.95（3H，s，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：47.9（C-1），69.0（C-2），83.4（C-3），39.6（C-4），55.9（C-5），18.2（C-6），33.8（C-7），48.8（C-8），48.7（C-9），38.9（C-10），23.9（C-11），122.6（C-12），144.3（C-13），42.8（C-14），28.8（C-15），24.2（C-16），46.9（C-17），42.3（C-19），31.5（C-20），34.8（C-21），33.9（C-22），29.8（C-23），17.5（C-24），17.8（C-25），17.9（C-26），26.5（C-27），180.1（C-28），33.9（C-29），24.2（C-30）。其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定其為Maslinic acid[16]。

化合物3：白色無(wú)定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.48（1H，d，J=9.8 Hz，H-3），4.29（1H，m，H-2），5.62（1H，br，s，H-21）1.00（3H，s，H-23），1.09（3H，s，H-24），1.32（3H，s,H-25），1.78（3H，s,H-26），1.06（3H，s，H-27），0.77(3H，d，J=6.4 Hz，H-29)，0.88（3H，d，J=6.0 Hz，H-30）。13C-NMR（125 MHz）δ：48.9（C-1），69.7（C-2），84.3（C-3），39.4（C-4），56.7（C-5），19.6（C-6），35.6（C-7），41.3（C-8），51.8（C-9），39.7（C-10），22.7（C-11），33.2（C-12），40.6（C-13），42.8（C-14），28.9（C-15），30.8（C-16），49.8（C-17），49.1（C-18），38.8（C-19），143.9（C-20），118.6（C-21），38.5（C-22），29.1（C-23），17.6（C-24），18.8（C-25），16.1（C-26），15.3（C-27），178.7（C-28），23.2（C-29），22.5（C-30）。其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定其為Psiguanin A[17]。

化合物4：白色無(wú)定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.50（1H，m，H-2），2.89（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），5.10（1H，br，s，H-12），0.86（3H，s，H-23），0.78（3H，s，H-24），0.79（3H，s，H-25），0.95（3H，s，H-26），1.02（3H，s，H-27），0.78（3H，d，J=6.4 Hz，H-29），0.88（3H，d，J=6.0Hz，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：48.1（C-1），69.9（C-2），80.9（C-3），40.8（C-4），56.0（C-5），19.9（C-6），34.6（C-7），41.2（C-8），49.2（C-9），39.5（C-10），24.7（C-11），126.9（C-12），139.1（C-13），43.8（C-14），29.8（C-15），25.6（C-16），48.0（C-17），54.7（C-18），40.0（C-19），40.9（C-20），32.2（C-21），38.7（C-22），29.9（C-23），17.9（C-24），17,1（C-25），17.4（C-26），24.8（C-27），180.6（C-28），17.6（C-29），21.3（C-30）。其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定其為2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid[18]。

表1 三萜酸抑制LPS刺激RAW264.7細(xì)胞NO釋放

化合物5：白色無(wú)定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.45（1H，m，H-2），2.96（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），5.15（1H，br，s，H-12），0.89（3H，s，H-23），0.85（3H，s，H-24），0.85（3H，s，H-25），0.99（3H，s，H-26），1.05（3H，s，H-27），0.82（3H，d，J=6.4Hz，H-29），0.92（3H，d，J=6.0Hz，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：48.6（C-1），70.2（C-2），80.5（C-3），41.2（C-4），56.5（C-5），19.4（C-6），34.8（C-7），41.4（C-8），49.7（C-9），40.0（C-10），24.9（C-11），125.9（C-12），139.6（C-13），43.2（C-14），29.2（C-15），25.1（C-16），48.2（C-17），54.4（C-18），40.2（C-19），41.2（C-20），32.7（C-21），38.2（C-22），30.0（C-23），17.2（C-24），17,5（C-25），17.3（C-26），24.1（C-27），180.2（C-28），17.9（C-29），21.7（C-30）。其1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定其為2α-hydroxy ursolic acid[19,20]。

化合物6：白色無(wú)定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.52（1H，m，H-2），3.12（1H，d，J=9.0 Hz，H-3），5.65（1H，br，s，H-12），0.94（3H，s，H-23），0.93（3H，s，H-24），0.95（3H，s，H-25），0.99（3H，s，H-26），1.10（3H，s，H-27），1.25（3H，d，J=7.8 Hz，H-29），5.82（1H，br，s，H-30），5.94（1H，br，s，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：47.1（C-1），70.8（C-2），80.9（C-3），41.5（C-4），56.7（C-5），19.9（C-6），34.1（C-7），41.9（C-8），50.1（C-9），40.6（C-10），25.5（C-11），126.3（C-12），139.1（C-13），43.8（C-14），29.6（C-15），25.8（C-16），48.5（C-17），54.8（C-18），39.1（C-19），154.8（C-20），31.7（C-21），38.6（C-22），16.9（C-23），17.8（C-24），17.9（C-25），17.8（C-26），24.5（C-27），178.9（C-28），18.1（C-29），105.4（C-30）。其1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定其為2α,3αdihydroxyursa-12,20(30)-dien-28-oic acid[18]。

化合物7：白色無(wú)定型粉末（甲醇）。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.58（1H，m，H-2），3.12（1H，d，J=9.8 Hz，H-3），5.65（1H，br，s，H-12），3.67（1H，d，J =13.8 Hz，H-23），3.52（1H，d，J = 13.8 Hz，H-23），0.91（3H，s，H-24），0.96（3H，s，H-25），1.02（3H，s，H-26），1.12（3H，s，H-27），1.20（3H，d，J=7.8 Hz，H-29），5.78（1H，br s，H-30），5.82（1H，br s，H-30）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：49.3（C-1），71.5（C-2），81.5（C-3），41.8（C-4），56.9（C-5），19.9（C-6），34.1（C-7），41.0（C-8），49.2（C-9），40.4（C-10），24.1（C-11），125.0（C-12），140.2（C-13），43.0（C-14），29.9（C-15），25.7（C-16），48.8（C-17），54.8（C-18），40.8（C-19），153.6（C-20），32.1（C-21），38.8（C-22），71.9（C-23），17.8（C-24），17.0（C-25），17.8（C-26），24.2（C-27），180.8（C-28），17.1（C-29），104.9（C-30）。其1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定其為2α,3αdihydroxyursa-12,20(30)-dien-28-oic acid[21]。

3.2 化合物對(duì)NO釋放情況測(cè)定

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)7 個(gè)三萜酸都具有較好的抑制NO釋放作用（表1）。由于7個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式非常相似，所以他們體現(xiàn)出的抑制NO 釋放的活性基本一致，沒(méi)有明顯的差異性，也沒(méi)有體現(xiàn)出一定的構(gòu)效關(guān)系。

3.3 化合物對(duì)炎癥因子TNF-α和IL-6釋情況測(cè)定

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)7 個(gè)化合物在高濃度的情況具有較好的抑制炎癥因子TNF-α及IL-6 的釋放（圖2）。7個(gè)化合物在高劑量時(shí)（60 μM）對(duì)TNF-α及IL-6的釋放具有明顯的抑制作用，在中劑量時(shí)（30 μM）體現(xiàn)出一定的活性，但是不明顯，低劑量（15 μM）幾乎沒(méi)有活性。

4 討論

丹參作為一味常見(jiàn)的活血化瘀類中藥，具有悠久的中醫(yī)臨床應(yīng)用歷史。目前，以關(guān)鍵詞“Danshen”或“丹參”在PubMed 或CNKI 分別搜到2 975 篇和48 998篇文章，可見(jiàn)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)丹參研究的非常廣泛且深入。有很多研究顯示，丹參具有很明顯的抗炎活性[22,23]，尤其是丹酚酸和丹參酮抗炎效果及機(jī)制非常明確。丹酚酸和總丹參酮對(duì)各種炎癥模型的動(dòng)物都一定治療作用，如組織胺造模的血管通透性增加大鼠，蛋清、角叉菜膠或右旋糖酐造模的關(guān)節(jié)炎腫痛的大鼠，巴豆油、二甲苯造模耳腫脹的小鼠等[7]。其作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路，達(dá)到抑制溶酶體、炎癥因子（TNF-α，IL-1β，IL-6，NO，PGE2 等）釋放及中性粒細(xì)胞趨化性，起到減少炎癥滲出效果，從而達(dá)到抗炎效果[24]。本研究采用ELISA 方法檢測(cè)了7 個(gè)三萜酸對(duì)炎癥因子TNF-α和IL-6 的影響。結(jié)果顯示，7 個(gè)三萜酸都具有很好抑制炎癥因子釋放的作用。此外，本研究還采用Griess 試劑檢測(cè)NO 釋放，NO 在機(jī)體內(nèi)極不穩(wěn)定，容易生成NO2-，NO2-與Griess 試劑發(fā)生反應(yīng)生成重氮化合物[25]。因此，重氮化合物與NO成一定的線性關(guān)系，從而反應(yīng)了NO 的含量。NO 的生成主要是由一氧化氮合成酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）的作用下催化L-精氨酸生成的[26,27]。NOS 有三種形式eNOS、nNOS、iNOS。其中，eNOS主要調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生成NO，參與血管功能調(diào)控；nNOS 在神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)控NO 產(chǎn)生，參與細(xì)胞通訊及信息存儲(chǔ)；iNOS 在誘導(dǎo)情況下產(chǎn)生NO，參與機(jī)體免疫與抗炎反應(yīng)等[26,27]。但是，本研究只是檢測(cè)NO 釋放情況，相關(guān)的iNOS 的活性及表達(dá)則沒(méi)有進(jìn)一步研究。綜上所述，本研究從丹參中分離鑒定了7個(gè)三萜酸，其中4個(gè)屬于本植物首次分離，豐富了丹參中的化學(xué)成分種類。此外，本研究初步探索了三萜酸抗炎活性，證實(shí)了7 個(gè)三萜酸都具有一定的抗炎活性，初步闡述了丹參發(fā)揮抗炎作用物質(zhì)基礎(chǔ)，但是，其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入探索。