TLR4/MyD88介導的炎癥反應在體外培養(yǎng)癲癇海馬組織中的作用☆

葉潔梅 黃國雄 蔡志玲 伍桂雄 黃媛恒

近年來，癲癇與免疫相關的學說漸漸倍受關注，異常免疫反應可能是癇性發(fā)作和癲癇形成的始動因素之一，小膠質細胞、星型膠質細胞和神經元可作為免疫活性細胞，參與和影響炎癥反應，TLR4是Toll樣受體家族（Toll-like receptors,TLRs）受體家族重要成員，TLR4是小膠質細胞、星型膠質細胞和神經元的重要炎性受體，促進炎性細胞因子和免疫調控分子表達，影響癲癇的發(fā)生和進展，具體作用尚不十分清楚[1]。本研究擬體外觀察大鼠海馬癲癇組織中細胞TLR4介導的炎癥因子IL-1β、IL-6和通路蛋白MyD88，進一步闡明癲癇發(fā)病中的炎癥作用。

1 材料與方法

1.1 體外自發(fā)性癲癇樣放電海馬腦片模型制備取新生6～9 d SD鼠，用 75%乙醇浸泡消毒后，無菌條件下分離出完整的海馬，置于無菌的3%瓊脂塊凹槽中，于振動切片機的載物平臺上，4℃HBSS液中以400 μm厚度進行切片。在 6孔培養(yǎng)板內插入微孔濾膜，將完好的海馬腦片分放在各孔內的濾膜上，各孔內加1.3 mL的完全培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2、平衡濕度的條件下培養(yǎng)，每周半量更換培養(yǎng)液2次，倒置相差顯微鏡下觀察生長情況，培養(yǎng)至7 d。人工腦脊液（artificial cerebral spinal fluid,ACSF） 成分 （mmol/L）：NaCI 124、KCI 3.3、KH2PO41.2、NaHCO326、CaCL22.5、MgSO42.4、葡萄糖10，PH 7.4。腦片在ACSF中通95%O2及5%CO2孵育至少1 h，實驗時改用未加Mg2+ACSF（即無Mg2+ACSF）灌流 3 h，制備自發(fā)性癲癇樣放電海馬腦片模型，于造模前和造模后1 d、3 d、7 d各時點收集樣品進行檢測。

1.2 qRT-PCR檢測 于造模前和造模后1 d、3 d、7 d各個時間點收取組織標本，冰上碾磨，提取海馬組織總RNA（Invitrogen公司），電泳及紫外分光光度計鑒定純度，根據逆轉錄試劑盒合成cDNA（Promega公司）。用SYBR Green熒光染料 （Bio-Rad公司），根據試劑盒說明書完成40個PCR循環(huán)，收集熒光信號并分析結果。每個樣品均設3個復孔，采用公式2-△△CT計算各目的基因mRNA的表達水平。實驗重復3次。

1.3 Western blot檢測 于造模前后 1 d、3 d、7 d各時點，用蛋白提取試劑盒按操作說明提取細胞總蛋白,紫外線分光光度計測定蛋白濃度后煮沸變性，SDS-PAGE凝膠電泳，電轉4 h至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入待檢測蛋白單克隆抗體（Bioss、Abbkine 公司），4℃孵育過夜,洗膜3次，加入二抗，室溫孵育 1 h，洗膜，顯色曝光，分析TLR4和信號蛋白MyD88的表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0進行分析，采用±s進行描述。數據符合正態(tài)分布，多個樣本間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 TLR4、MyD88、IL-1β 和 IL-6 mRNA 水平qRT-PCR結果顯示，和造模前大鼠正常海馬組織對照組相比，造模后1 d、3 d、7 d癲癇樣放電海馬腦片中各時間點TLR4、MyD88 mRNA的相對表達水平均明顯增高（P＜0.001），同樣，炎性細胞因子IL-1β和IL-6 mRNA的相對表達水平也明顯增高（P＜0.001）（見圖 1）。

圖1 大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬腦片中T L R 4、M y D 8 8、I L-1 β和I L-6m R N A水平(與正常對照組相比，***P＜0.0 0 1)

2.2 TLR4和MyD88蛋白水平 Western blot結果顯示，和造模前大鼠正常海馬組織對照組相比，造模后 1 d、3 d、7 d各個時間點的 TLR4、MyD88 蛋白的表達水平均明顯增高（P＜0.001）（見圖 2）。

圖2 大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬腦片中T L R 4和M y D 8 8蛋白水平

3 討論

近年來，大量臨床和實驗研究證據表明，腦部炎癥反應可能是癇性發(fā)作和癲癇形成的重要機制之一，癲癇發(fā)作后快速誘導的炎癥反應，包括神經元、小膠質細胞、星形膠質細胞、血腦屏障內皮細胞和外周免疫細胞的活化以及局部炎性細胞因子的分泌，炎癥反應同時也可誘導癲癇發(fā)作，促進海馬發(fā)生病理性改變，如神經元損傷丟失、膠質細胞再生、苔鮮纖維發(fā)芽等[2-4]。TLR4在腦組織中主要表達于星形膠質細胞、小膠質細胞及神經元。目前國內外關于TLR4及其信號通路與癲癇關系的研究較少。MAROSO等[5]發(fā)現在海人藻酸致癇小鼠急性期和慢性期海馬內 TLR4在 CA1、CA3、DG區(qū)星形膠質細胞和神經元上表達增多，TLR4基因敲除或TLR4拮抗劑處理小鼠能對抗海人藻酸所致的癇性發(fā)作。RODGER等[6]應用LPS對大鼠皮質進行研究，當LPS與TLR4結合后，誘發(fā)場電位的幅度增加3倍，并引發(fā)局部癲癇樣放電，而此效應可以被IL-IR拮抗劑阻斷。DAS等[7]對出生后2周的大鼠注射LPS，激活TLR4，誘發(fā)輕微的炎癥反應，當這些大鼠成年后對海人酸、匹羅卡品或戊四氮誘發(fā)癲癇的易感性增加。本實驗研究觀察到體外新生SD大鼠海馬神經元無鎂細胞外液所致難治性癲癇模型中TLR4蛋白及mRNA增高，且隨時間的延長而增強，與上述研究結果相一致。

MyD88是TLR4介導信號通路的重要胞內接頭蛋白，具有負責募集下游信號分子的 N端死亡結構域（death domain，DD）和承接 TLRs活化信號的C端TIR結構域。TLR4與內源性配體如熱休克蛋白、脂 多 糖 （lipopolysaccharide，LPS）等激活后，通過TIR結構域募集MyD88樣接頭蛋白MAL（MyD88 adaptor-like protein，MAL） 和 MyD88，與IRAK（IL-1 receptor-associated kinase，IRAK） 家族蛋白分子結合成為信號轉導復合物，后者磷酸化而脫離 MyD88/I-RAK復合體，結合并激活接頭蛋白TNF受體相關因子（TNFR-associationfactor6,TRAF6），促使NF-κB由胞漿轉移到胞核內，發(fā)揮轉錄調控作用，激活 IL-1β、IL-8、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）、補體、趨化因子等基因表達，最終導致炎癥因子釋放[8-11]。本實驗結果顯示，模型組大鼠癲癇樣放電海馬組織中，MyD88的mRNA和蛋白的升高，炎性因子IL-1β和IL-8 mRNA升高，表明其可能通過MyD88通路誘發(fā)炎癥反應。

鄭軍（1971-），男，山東乳山人，博士，山東農業(yè)大學經濟管理學院教授，主要研究領域：農業(yè)經濟理論與政策。

綜上所述，本研究表明，癲癇腦組織中的神經細胞、星型膠質細胞、小膠質細胞膜表面表達的TLR4可作為受體，通過MyD88通路，引起炎癥因子的分泌增多，可能是癲癇的異常免疫機制之一，免疫調節(jié)和抗炎治療可能是癲癇治療的潛在新靶點。