趙靖康 韓雙羽 劉慧峰 任媛 王霞 劉旭 何媛

青光眼在全球是僅次于白內(nèi)障的導致視力喪失的主要病因[1]。預計到2040年，全世界的青光眼患者將超過1.1億[2]。眼壓在青光眼的發(fā)病機制中發(fā)揮著極其重要的作用，因此通過實驗升高眼壓導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞退行性改變的動物模型一般認為是最適用于模擬人類青光眼的動物模型。高眼壓的青光眼動物模型可以更好地篩選出能夠商業(yè)化的降眼壓藥物[3]。嚙齒類動物和人類的眼睛在解剖學上具有許多共同的重要特征，包括前房引流結構和房水動力學[4]。大鼠和小鼠與人眼的生理機能相似，且具有廉價、易于維持、生命周期相對較短及易于進行遺傳操作等優(yōu)點，故適宜作為青光眼模型[5]。

卡波姆是丙烯酸鍵合烯丙基蔗糖或季戊四醇而形成的高分子聚合物，有良好的乳化性、增稠性、助旋性和成膜性[6]?？ú穚H值較低時呈溶液狀，隨著pH值的升高，其黏稠度逐漸增加?？ú愤M入前房后，與pH值為7.3～7.5的房水形成卡波姆混懸液，隨著房水循環(huán)卡波姆凝膠阻塞小梁網(wǎng)，從而升高眼壓[7-8]。本研究擬通過對大鼠前房注射卡波姆建立穩(wěn)定的大鼠高眼壓模型，觀察卡波姆升眼壓效果及對大鼠眼前節(jié)和視網(wǎng)膜的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物健康8周齡SD大鼠30只，雌雄各半，體質量250～300 g，所有動物均由西安交通大學實驗動物中心提供。雌雄鼠分開飼養(yǎng)。實驗遵循實驗動物保護條例，并通過西安醫(yī)學院動物實驗委員會批準。

1.1.2 卡波姆混懸液的配制取0.15 g卡波姆940(上海索萊寶生物科技有限公司)放入燒杯內(nèi)，加入蒸餾水30 mL后，用磁力攪拌器(韓國Daihan scientific有限公司)攪拌20 min，使混懸液變成半透明狀。使用100 g·L-1氫氧化鈉溶液滴定，使混懸液pH值為7.3～7.5。

1.2 方法

1.2.1 注射前的準備每只大鼠注射前均經(jīng)過連續(xù)3 d基礎眼壓的測量，測量前按摩大鼠，消除其緊張情緒，每次均測量3次取平均值記錄。使用100 g·L-1水合氯醛按3.5～4.0 mL·kg-1體質量腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠右眼定為實驗眼，前房內(nèi)注射1 mL卡波姆混懸液，左眼為對照眼不做處理。實驗眼注射前常規(guī)剪去大鼠胡須。

1.2.2 注射方法大鼠麻醉后用顯微鑷夾住結膜固定眼球。使用1 mL注射器抽取卡波姆混懸液 1 mL，連接到30 G針頭上，在顯微鏡下將注射器針頭于角膜緣外1 mm處穿刺進入前房，針頭避免與晶狀體前囊、虹膜和角膜內(nèi)皮接觸，抽出針頭，隨著房水的流出，前房變淺，眼球變軟。然后從原傷口進針，進入前房后轉動針頭，使注射器的針頭斜面朝向房角，將30 μL 5 g·L-1卡波姆混懸液快速注射并推入前房。此時虹膜血管顏色淡，前房深。隨著眼壓的升高，部分卡波姆從穿刺口流出，抽出針頭的同時，助手立即用無齒鑷夾住結膜傷口持續(xù)約1 min，然后用左氧氟沙星眼膏(參天制藥中國有限公司)涂抹于角膜表面，待大鼠蘇醒后放入籠內(nèi)。之后用左氧氟沙星滴眼液(參天制藥中國有限公司)滴眼，每天2次，連續(xù)7 d。

1.2.3 眼前節(jié)觀察分別于注射后即刻及每周末進行眼前節(jié)照相，觀察并記錄眼前節(jié)組織結構的變化情況。

1.2.4 注射后眼壓的測量大鼠清醒狀態(tài)下，用回彈式眼壓計(天津索維電子技術有限公司)測量眼壓，眼壓計默認測量3次的平均值作為一個眼壓值。注射后每日早10時和晚22時測量眼壓。

1.2.5 組織病理學觀察注射后4周，保留4只實驗眼持續(xù)高眼壓狀態(tài)的大鼠繼續(xù)觀察至注射后9周，余26只大鼠均處死后迅速摘除雙眼眼球，并于40 g·L-1多聚甲醛中固定，24 h后梯度酒精脫水，將浸蠟的組織包埋，平行于眼軸方向切片，切片厚4 μm，烤片、脫蠟，HE染色后選取實驗眼和對照眼均完整切到視神經(jīng)的切片，用圖像處理軟件分別測量距離視神經(jīng)200 μm處的視網(wǎng)膜厚度并對比。同時對比同一只大鼠雙眼HE染色切片，觀察實驗眼和對照眼的房角形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學分析應用PASW Statistics 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用組間獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 眼壓注射前，實驗眼白天眼壓為(11.10±0.90)mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，夜間眼壓為(11.92±1.07)mmHg；對照眼白天、夜間眼壓分別為(11.22±1.07)mmHg和(11.76±1.08)mmHg。經(jīng)統(tǒng)計學分析，大鼠實驗眼與對照眼之間，白天、夜間眼壓差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；實驗眼白天眼壓比夜間低(0.80±1.20)mmHg，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)，對照眼白天眼壓比夜間低(0.58±1.38)mmHg，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。注射后，26只實驗眼高眼壓均可以維持4周，另外4只實驗眼眼壓可以維持在20 mmHg以上達6～9周。注射后第1天至第27天，實驗眼與對照眼夜間眼壓相比差異均具有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；注射后第28天，實驗眼與對照眼夜間眼壓相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。注射后第1天至第19天，實驗眼與對照眼白天眼壓相比差異均具有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；注射后第20天，實驗眼與對照眼白天眼壓相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 實驗眼、對照眼不同時間點眼壓的變化。黑色箭頭示注射日

2.2 眼前節(jié)改變注射后即刻行眼前節(jié)照相可見，對照眼眼前節(jié)未見異常(圖2A)；實驗眼半透明的卡波姆沉積于前房，由于眼壓升高，虹膜血管顏色變淡，瞳孔大小與對照眼相當(圖2B)。注射后1周，實驗眼出現(xiàn)典型的兩種卡波姆存在方式：(1)彌散型：卡波姆彌散在前房，呈薄霧狀，虹膜血管窺不清(圖3A)；(2)沉積型：卡波姆沉積于瞳孔區(qū)，呈團塊狀(圖3B)。計算兩種卡波姆沉積方式實驗眼1周內(nèi)的平均眼壓，彌散型為(17.83±3.54)mmHg，沉積型為(13.00±1.55)mmHg，兩者相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高眼壓維持至實驗結束(注射后9周)的大鼠眼前節(jié)觀察可見，對照眼前房透明，虹膜血管清晰可見(圖4A)；注射后1周，卡波姆呈云霧狀，新生血管長入角膜，卡波姆界限明顯，眼球突出于眼瞼，使眼瞼閉合不全(圖4B)；注射后3周時卡波姆較1周時局限(圖4C)，夜間眼壓維持在25 mmHg；注射后6周，眼壓依然維持在25 mmHg，卡波姆呈團塊狀沉積于前房，眼球突出更加明顯，角膜水腫，有潰瘍面(圖4E)，裂隙燈下檢查發(fā)現(xiàn)，前房消失(圖4F)。

圖2 注射后即刻眼前節(jié)照相。A：對照眼；B：實驗眼

圖3 實驗眼前房注射卡波姆后的兩種存在方式。A：卡波姆呈彌散型；B：卡波姆呈沉積型

圖4 高眼壓維持的實驗眼前房注射卡波姆后不同時間觀察。A：對照眼；B：注射后1周；C：注射后3周；D：注射后6周；E：注射后9周；F：注射后9周裂隙燈下

2.3 視網(wǎng)膜形態(tài)和厚度對比注射后4周，實驗眼視網(wǎng)膜全層變薄，內(nèi)叢狀層厚度減少，內(nèi)外核層融合為一層，細胞排列紊亂，神經(jīng)節(jié)細胞明顯減少；對照眼視網(wǎng)膜各層結構清晰，神經(jīng)節(jié)細胞清晰可見(圖5)。實驗眼注射后4周視網(wǎng)膜厚度為(254.70±21.80)μm，對照眼為(346.73±24.63)μm，實驗眼與對照眼視網(wǎng)膜厚度相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。

2.4 房角形態(tài)對比注射后4周，對照眼房角形態(tài)正常，可以觀察到虹膜血管及睫狀體(圖6A)；實驗眼前房充滿卡波姆及虹膜的混合成分，緊貼角膜內(nèi)皮并延伸至房角，堵塞小梁網(wǎng)結構，正常虹膜形態(tài)消失(圖6B)。

圖5 注射后4周實驗眼與對照眼視網(wǎng)膜形態(tài)對比(HE，×200)。A：實驗眼；B：對照眼

圖6 注射后4周房角形態(tài)對比。A：對照眼；B：實驗眼(黑色箭頭示前房內(nèi)卡波姆與虹膜的混合成分)

3 討論

青光眼動物模型根據(jù)眼壓升高的機制可分為小梁前、小梁和小梁后模型[9]。小梁前模型由不同類型的外源性物質(如硫酸軟骨素、甲基纖維素、聚苯乙烯微珠等)注入前房內(nèi)來阻礙房水流出，這種方法保留了眼部正常的解剖結構，炎癥反應相對較輕。小梁模型最廣泛造模方法是小梁激光光凝術，這種方法通常需要多次激光光凝才能維持數(shù)周的高眼壓，由于嚙齒類動物眼睛尺寸太小而難以施行。小梁后模型針對鞏膜后靜脈進行不同方法的處理，如激光凝固、燒灼或高滲鹽水注射等[10]。小梁后模型實現(xiàn)了快速但短期的持續(xù)眼壓升高，但它們存在諸如眼球突出和角膜內(nèi)皮失代償?shù)炔焕蛩豙11]；激光對靜脈的處理也可能損傷睫狀神經(jīng)，鞏膜靜脈阻塞可引起角膜緣或脈絡膜局部缺血、缺氧變化，以上弊端可能會對實驗結果產(chǎn)生根本性的影響[12-13]。國內(nèi)外報道的前房注射外源性物質阻塞房水排出的模型，注射體積一般都小于15 μL，但我們的預實驗發(fā)現(xiàn)，注射15 μL卡波姆混懸液時，卡波姆容易沉積在瞳孔區(qū)，升眼壓效果并不明顯[14]，而注射30 μL卡波姆混懸液，可以使前房充滿卡波姆，升眼壓效果穩(wěn)定。Frankfort等[15]使用22 G玻璃針對大鼠前房注射6 μm和10 μm的混合微珠從而升高眼壓，其采用透明角膜的穿刺方法，通過特殊制成的針頭，在針管末端抽取黏彈劑，黏彈劑的作用是使微珠漏出的量減少。該方法用針頭較本實驗粗，在透明角膜上的穿刺口有感染的風險。

本實驗的重點在于手術過程中如何將盡可能多的卡波姆留在前房內(nèi)。在模型優(yōu)化過程中，我們比較了不同濃度卡波姆混懸液的升眼壓效果，發(fā)現(xiàn)5 g·L-1的卡波姆混懸液是獲得大鼠持續(xù)高眼壓的最有效濃度。30 G的注射器針頭可以順利排出濃度為5 g·L-1的卡波姆混懸液，更高濃度的混懸液不利于卡波姆的排出。采用結膜下進針、穿刺進入前房及針頭斜面朝向角膜緣的方法，可以使卡波姆沿著房角分布[16]。出針時用無齒鑷夾住傷口避免卡波姆從前房漏出，可使更多的卡波姆留在眼內(nèi)[17]。

注射后前房深度、前房混濁程度及虹膜血管顏色是判斷眼壓高低的指標。我們發(fā)現(xiàn)，注射后實驗眼前房混濁、卡波姆呈彌散狀、虹膜血管顏色淡的大鼠眼壓相對較高，并且可以維持高眼壓水平較長時間；而注射后卡波姆分布不夠均勻、虹膜血管部分清晰可見、卡波姆最后沉積在瞳孔區(qū)的大鼠，升眼壓效果相對較差，維持時間相對較短。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是彌散的卡波姆會產(chǎn)生不同質量的卡波姆凝膠顆粒，對小梁網(wǎng)的阻塞效果更好，而凝聚成團的卡波姆無法釋放小分子卡波姆凝膠顆粒。以往的大鼠高眼壓模型均只取白天眼壓作為讀數(shù)，并未提及夜間眼壓，本實驗發(fā)現(xiàn)，實驗眼夜間眼壓明顯高于對照眼及白天眼壓。吉富健志[18]使用熒光光度計進行家兔房水產(chǎn)生的測定，發(fā)現(xiàn)房水的產(chǎn)生量在明室內(nèi)下降，在暗室內(nèi)增加。所以推測本組大鼠高眼壓產(chǎn)生晝夜波動的原因可能是夜間暗室環(huán)境中產(chǎn)生的房水大量增加引起。實驗眼眼壓升高4周可出現(xiàn)視網(wǎng)膜改變，4周后，眼壓下降的大鼠數(shù)目增多，視網(wǎng)膜修復可能出現(xiàn)。

本實驗方法屬于小梁前模型，通過卡波姆阻塞房水流出通路來升高眼壓，單次注射可維持眼壓升高4周以上，注射后眼壓的晝夜波動符合人類青光眼的特點。

綜上，卡波姆前房注射建立大鼠高眼壓模型引起晝夜眼壓升高的效果理想，操作簡便，重復性好，副作用少，升高的眼壓維持穩(wěn)定，是較為理想的大鼠高眼壓模型，值得進一步研究。