付瑞，丁紹威，劉夢(mèng)蝶，胡偉，黃開泉，胡超杰，李慶

(1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥230001；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

急性腦梗死(ACI)是一類危害性較高的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是血栓性腦梗死發(fā)生的主要原因之一[1]。由于群體的特殊性，老年人更容易突發(fā)ACI[2]。老年人身體存在一系列衰老改變，包括內(nèi)分泌環(huán)境及免疫系統(tǒng)等的衰老改變。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，調(diào)控血管平滑肌收縮和舒張的因子表達(dá)水平發(fā)生變化，進(jìn)而影響了血管內(nèi)環(huán)境平衡，最終導(dǎo)致血栓形成[3]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)是2007年新發(fā)現(xiàn)的一類不同于Th1、Th2的CD4+輔助性T細(xì)胞，其可分泌多種細(xì)胞因子，其中白細(xì)胞介素17(IL-17)是Th17的主要效應(yīng)因子，IL-17在炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病等的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[4，5]。目前對(duì)Th17在衰老和ACI發(fā)生中的作用尚未完全闡明。本研究觀察了健康老年人、老年ACI患者外周血Th17比例及血清IL-17、血管黏附分子1(VCAM-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老指標(biāo)內(nèi)皮素1(ET-1)、炎癥標(biāo)志物氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)水平的變化，分析Th17比例及IL-17與VCAM-1、ET-1、ox-LDL的相關(guān)性，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年5月～2018年4月在安徽省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的老年ACI[6]患者33例(老年腦梗組)，男17例、女16例，均為初診ACI患者。選取同期在院進(jìn)行體檢的不同年齡段健康人為對(duì)照，排除有心腦血管意外病史者，參照WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)，青年(44歲以下)28人(健康青年組)、中年(45～60歲)29人(健康中年組)、老年(60歲以上)32人(健康老年組)[7]。各組性別比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。健康老年組空腹血糖、TG、LDL水平高于健康青年組和健康中年組，而老年腦梗組高于健康老年組(P均<0.05)。見表1。所有研究對(duì)象排除腫瘤、感染、全身免疫性疾病、嚴(yán)重肝腎疾病、血液系統(tǒng)疾病，未服用免疫抑制劑和非甾體類抗炎藥。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

表1 各組年齡、性別、血糖、血脂指標(biāo)比較

注：與各組健康人群比較，★P<0.05；與健康老年組比較，△P<0.05。

1.2 外周血Th17檢測(cè) 抽取各組5 mL全血用生理鹽水稀釋一倍后緩慢加到淋巴細(xì)胞分離液上層，550 r/min 4 ℃離心20 min，棄去上清，小心吸取中層細(xì)胞獲得單個(gè)核細(xì)胞。再經(jīng)PBS洗滌細(xì)胞2次后，加RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以2×106/mL接種到24孔板，每孔1 mL。加入混合型細(xì)胞刺激劑cocktail 2 μL，并用加樣槍充分混勻細(xì)胞懸液，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)4～6 h后將細(xì)胞收集到試管中，加PBS洗滌后1 200 r/min離心5 min，留取約100 μL液體。向管中加入FITC-CD4 5 μL，用渦旋震蕩器震蕩混勻，4 ℃避光孵育30 min；再在每管中加入適量PBS，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液后加入細(xì)胞固定劑100 μL，震蕩混勻后，4 ℃避光反應(yīng)15 min；加入PBS，1 200 r/min離心5 min洗滌；棄上清，向每管加入100 μL細(xì)胞破膜劑，4 ℃避光反應(yīng)5～10 min，向檢測(cè)管中加入PE-IL17A 5 μL，對(duì)照管中則加相應(yīng)的同型對(duì)照PE 5 μL，混勻，4 ℃避光孵育15～20 min；再次用PBS以1 200 r/min離心5 min洗滌，加500 μL的PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)調(diào)整流式細(xì)胞儀后，對(duì)淋巴細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門，在淋巴細(xì)胞群中再對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞設(shè)門。每份標(biāo)本獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞數(shù)達(dá)到10 000個(gè)，使用Diva Software V6.1.3進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 血清IL-17、ET-1、VCAM-1、ox-LDL檢測(cè) 將抽取的全血放入非抗凝生化管，室溫靜置2 h待血清充分析出后以低速離心機(jī)3 000 r/min離心5 min，收集血清(溶血標(biāo)本棄去)，-80 ℃冰箱低溫保存。采用ELISA法檢測(cè)血清IL-17、ET-1、ox-LDL、VCAM-1，操作步驟按照試劑操作說明書進(jìn)行，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)其在450 nm波長(zhǎng)處的OD值。每份標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線孔并設(shè)置空白對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的OD值與濃度得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線代入標(biāo)本實(shí)測(cè)OD值換算出濃度值。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血Th17比例比較 健康青年組、健康中年組、健康老年組和老年腦梗組的外周血Th17比例分別為0.96%±0.18%、1.47%±0.30%、2.38%±0.33%、4.09%±1.07%。老年腦梗組外周血Th17比例高于各組健康人群(P均<0.05)；健康老年組外周血Th17比例高于健康青年組和健康中年組(P均<0.05)。見表2。

2.2 各組血清IL-17、ET-1、VCAM-1、ox-LDL比較 老年腦梗組血清IL-17、ET-1、VCAM-1、ox-LDL水平高于各組健康人群(P均<0.05)；健康老年組血清IL-17、ET-1、VCAM-1、ox-LDL水平高于健康青年組和健康中年組(P均<0.05)。見表2。

2.3 各組Th17比例、IL-17水平與ET-1、VCAM-1、ox-LDL水平的相關(guān)性 各組外周血Th17比例與血清VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平呈正相關(guān)(r分別為0.847、0.815、0.809，P均<0.01)。血清IL-17水平與血清VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平亦呈正相關(guān)(r分別為0.770、0.715、0.744，P均<0.01)。見圖1。

表2 各組人群外周血Th17比例和血清IL-17、ET-1、VCAM-1、ox-LDL水平比較

注：與健康青年組和健康中年組比較，★P<0.05；與健康老年組比較，△P<0.05。

圖1 外周血Th17比例、血清IL-17水平與血清VCAM-1、ox-LDL、ET-1水平的相關(guān)性

3 討論

隨年齡增長(zhǎng)，機(jī)體的結(jié)構(gòu)及組織代謝率等各方面指標(biāo)都有所下降。有學(xué)者把機(jī)體的細(xì)胞免疫指標(biāo)改變作為衰老的特征[8]?，F(xiàn)有研究[9，10]曾報(bào)道老年人及小鼠體內(nèi)Th17比例和功能改變情況。ACI的發(fā)生主要是由向腦部供應(yīng)血液的動(dòng)脈發(fā)生血栓導(dǎo)致，其主要病理學(xué)基礎(chǔ)為AS及斑塊的破裂。AS是心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。AS的病因?qū)W說有很多，包括內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)代謝異常、炎癥學(xué)說等，但具體發(fā)生機(jī)制尚未明確，其中，炎癥學(xué)說日益受到學(xué)者的認(rèn)可[11,12]。AS也被認(rèn)為是一種炎癥性疾病，T細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13]。

Th17是由初始T細(xì)胞在IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等的誘導(dǎo)下分化而成[11]。臨床研究中發(fā)現(xiàn)，在AS動(dòng)脈斑塊中有大量T細(xì)胞浸潤(rùn)，這其中就包含了Th17的存在。淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VCAM-1、ET-1等細(xì)胞因子和趨化因子[14]，這些因子又促進(jìn)斑塊破裂形成血栓。Th17被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的致病因素之一，參與粥樣斑塊破裂的炎癥過程[15]。衰老與T細(xì)胞免疫有關(guān)，包括胸腺萎縮和T細(xì)胞亞群變化[16]。但Th17在衰老進(jìn)程和ACI發(fā)生中的作用尚不明確。為了闡明Th17在衰老進(jìn)程和ACI發(fā)生中的作用，我們檢測(cè)了健康青年人、健康中年人、健康老年人及老年ACI患者外周血中的Th17。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康青年人和健康中年人相比，健康老年人外周血Th17比例及血清IL-17、VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平顯著提高。同時(shí)，老年ACI患者外周血Th17比例及血清IL-17、VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平均顯著高于健康老年人、健康中年人和健康青年人。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，外周血Th17比例、IL-17水平與VCAM-1、ET-1、ox-LDL均呈正相關(guān)。

內(nèi)皮細(xì)胞的衰老和損傷是血管病變的初始事件[17]。血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老過程中，VCAM-1和ET-1的過度表達(dá)使得白細(xì)胞聚集并黏附在內(nèi)皮細(xì)胞上，從而加劇了血管壁的破壞和組織缺氧的炎癥反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果顯示，老年人體內(nèi)Th17表達(dá)增高與內(nèi)皮細(xì)胞衰老有關(guān)，作為Th17的特異性因子，IL-17有可能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老，進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化和ACI發(fā)生。而ox-LDL為重要的致動(dòng)脈粥樣硬化因子。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增長(zhǎng)，ox-LDL水平增高。健康老年人較健康青年人和健康中年人體內(nèi)ox-LDL水平明顯上升，而老年ACI患者ox-LDL水平又明顯高于老年健康人群。這表明ox-LDL不僅在動(dòng)脈粥樣硬化、ACI發(fā)生中發(fā)揮重要作用，還與衰老密切相關(guān)。ACI病因復(fù)雜，脂質(zhì)代謝障礙為其病變基礎(chǔ)，但最重要的病理過程是巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL形成泡沫細(xì)胞并沉積在血管內(nèi)膜。Th17分泌的IL-17能夠誘導(dǎo)炎癥因子和趨化因子分泌，加重局部組織損傷[19]。在本研究中，Th17比例、IL-17水平與ox-LDL水平呈正相關(guān)，提示在衰老或ACI過程中，Th17、IL-17與ox-LDL之間存在相互作用關(guān)系。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)Th17參與ACI的發(fā)生[20]。

綜上所述，健康老年人外周血Th17比例及血清IL-17、VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平增高，在老年ACI患者增高更明顯；而且，Th17比例、IL-17水平與VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平均呈正相關(guān)。上述研究結(jié)果提示，Th17/IL-17可能在衰老及ACI的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。