季昳弛，喬德輝，周翔宇，何雪梅，楊輝，程煉

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

甲狀腺腫瘤是最常見的內(nèi)分泌腫瘤之一。甲狀腺腫瘤分為良、惡性，其中約80%的惡性甲狀腺腫瘤為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)[1～4]。大部分PTC預(yù)后較好，仍有部分患者術(shù)后復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前術(shù)前診斷PTC的金標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)針穿刺活檢(FNA)，然而受腫瘤大小、位置、性質(zhì)和操作人員水平等影響，約有30%的樣本不能確診。因此，尋找PTC診斷、術(shù)前風(fēng)險(xiǎn)評估、監(jiān)測復(fù)發(fā)的標(biāo)志物有重要意義[5]。微小RNA(miRNA)是長度為18～22 bp的非編碼單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA與PTC發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p等與PTC的生長有關(guān)，可協(xié)助FNA診斷[6]。Lee等[7]發(fā)現(xiàn)，miR-222、miR-146b與PTC的進(jìn)展及復(fù)發(fā)相關(guān)。研究表明，miR-9和miR-21在PTC術(shù)后復(fù)發(fā)患者中表達(dá)降低，二者有望作為監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)的標(biāo)志物[8]。文獻(xiàn)報(bào)道，在三陰性乳腺癌中，miR-1296能抑制細(xì)胞增殖并增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[9]。miR-1296還被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致處于細(xì)胞周期S期的細(xì)胞比例減少[10]。本研究觀察了miR-1296在PTC患者腫瘤組織及血清中的表達(dá)變化，分析miR-1296表達(dá)與PTC臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并初步探討miR-1296對PTC發(fā)生發(fā)展的影響機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 PTC組織及血清樣本來源 選取2015年6月～2016年6月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的甲狀腺腫瘤患者65例，其中PTC 30例、良性腫瘤35例。PTC患者中，男11例，女19例；年齡>45歲 17例，≤45歲13例；腫瘤直徑>2 cm 15例，腫瘤直徑≤2 cm 15例；單發(fā)腫瘤17例，多發(fā)腫瘤13例；T1期12例，T2～4期18例；N0期13例，N1期17例；ASA風(fēng)險(xiǎn)分級低危組19例，中高危組11例；經(jīng)典型PTC 26例，濾泡型PTC 4例；血清中甲狀腺球蛋白水平>77 ng/mL者16例，≤77 ng/mL者14例。良性腫瘤患者中，男10例，女25例；年齡>45歲15例，≤45歲20例；腫瘤直徑>2 cm 12例，腫瘤直徑≤2 cm 23例。術(shù)中取離體腫瘤組織及距腫瘤>1 cm的正常甲狀腺組織于液氮中速凍，-80 ℃保存。另選擇35例行甲狀腺手術(shù)的PTC患者，分別于術(shù)前1 d及術(shù)后1 d采集促凝外周血，離心取上清，-80 ℃保存。本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 PTC組織及血清miR-1296檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取100 mg組織在液氮中研磨成粉末，提取總RNA，檢測總RNA濃度及純度，瓊脂凝膠電泳成像檢測RNA完整性。取200 μL血清樣品，按照QIAGEN miRNeasy serum/plasma Kit試劑盒說明書提取血清RNA。分別取500 ng組織RNA或6 μL血清RNA，按照miScript Ⅱ RT kit試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。組織PCR反應(yīng)步驟：95 ℃ 15 min;然后95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。血清PCR反應(yīng)步驟：95 ℃ 15 min；然后94 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，共5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。組織檢測以U6作為內(nèi)參，血清檢測以cel-miR-39作為內(nèi)參。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達(dá)量。

1.3 miR-1296的生物學(xué)信息分析 通過Targetscan預(yù)測miR-1296靶基因，GEPIA分析TCGA、GTEx數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌基因表達(dá)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血清miR-1296對PTC的診斷價(jià)值，用MedCalc軟件分析ROC曲線下面積(AUC)及最佳截?cái)嘀?。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC組織、良性腫瘤組織及癌旁正常甲狀腺組織中miR-1296表達(dá)比較 PTC組織、良性腫瘤組織及癌旁正常甲狀腺組織中miR-1296相對表達(dá)量分別為0.61±0.12、0.62±0.11、1.59±0.38。PTC組織、良性腫瘤組織中miR-1296相對表達(dá)量低于癌旁正常甲狀腺組織(P均<0.05)。

2.2 miR-1296表達(dá)與PTC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 腫瘤直徑>2 cm者腫瘤組織中miR-1296相對表達(dá)量低于腫瘤直徑≤2 cm者，TNM分期Ⅱ～Ⅳ期者腫瘤組織中miR-1296相對表達(dá)量低于Ⅰ期者(P均<0.05)。詳見表1。

2.3 PTC患者手術(shù)前后血清miR-1296表達(dá)比較 患者手術(shù)前后血清miR-1296表達(dá)量分別為1.12±0.98、6.02±1.92。術(shù)后血清miR-1296表達(dá)量較術(shù)前增高(P<0.05)。

2.4 血清miR-1296對PTC的診斷效能 ROC曲線分析顯示，血清miR-1296診斷良性腫瘤和PTC的AUC分別為0.780、0.790。血清miR-1296診斷良性腫瘤的敏感度為81%，特異度為71%；診斷PTC的敏感度為64%，特異度為86%。見圖1。

表1 miR-1296相對表達(dá)量與PTC臨床病理參數(shù)的關(guān)系(M)

圖1 血清miR-1296診斷PTC的ROC曲線

2.5 miR-1296對PTC發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制 Targetscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MAP17可能是miR-1296的靶基因；GEPIA分析TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MAP17在甲狀腺癌中的表達(dá)升高。推測miR-1296可能通過負(fù)性調(diào)控MAP17表達(dá)，參與PTC的多個(gè)生物學(xué)過程。

3 討論

PTC是起源于甲狀腺濾泡細(xì)胞的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率明顯升高[11]。雖然PTC的手術(shù)效果很好，但仍有少數(shù)患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。超聲引導(dǎo)的FNA通常用于檢測原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性病變及復(fù)發(fā)性病變。PTC患者術(shù)后管理的目的是早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)[12]。目前超聲、CT、FDG-PET/CT檢查可用于檢測轉(zhuǎn)移性病變或復(fù)發(fā)，但這些檢查手段費(fèi)用較高且耗時(shí)。尋找PTC的血清學(xué)標(biāo)志物有助于解決這一問題[13]。

miRNA在人腫瘤形成和進(jìn)展中具有重要作用。多種miRNA在惡性腫瘤組織中異常表達(dá)或缺失[14]。某些特定miRNA可預(yù)測人類惡性腫瘤的惡性程度和臨床結(jié)局。許多癌基因或抑癌基因受miRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的靶向調(diào)節(jié)[15]。miRNA具有腫瘤促進(jìn)和腫瘤抑制活性，miRNA靶向治療有望成為惡性腫瘤治療的新方案。此外，miRNA編碼基因常受到遺傳改變(包括染色體重排和點(diǎn)突變)的影響，這種miRNA靶向遺傳改變已經(jīng)被認(rèn)為是惡性腫瘤的特異性標(biāo)簽[15]。因此，miRNA表達(dá)譜有望用于腫瘤診斷和預(yù)后評價(jià)。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-1296參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Tao等[16]認(rèn)為miR-1296可能參與了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Xu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1296通過靶向作用于SRPK1介導(dǎo)的PI3K/AKT途徑抑制肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Phan等[18]發(fā)現(xiàn)miR-1296在三陰性乳腺癌中發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用。而關(guān)于miR-1296在PTC中的表達(dá)報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，PTC組織、良性腫瘤組織中miR-1296相對表達(dá)量低于癌旁正常甲狀腺組織；腫瘤直徑>2 cm者腫瘤組織中miR-1296相對表達(dá)量低于腫瘤直徑≤2 cm者，TNM分期Ⅱ～Ⅳ期者腫瘤組織中miR-1296相對表達(dá)量低于Ⅰ期者。這提示miR-1296低表達(dá)可能參與了PTC的發(fā)病，并與PTC的進(jìn)展有關(guān)。對PTC患者血清miR-1296進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，術(shù)后血清miR-1296表達(dá)較術(shù)前增高，血清miR-1296對PTC的診斷敏感度為64%、特異度為86%，提示血清miR-1296檢測對PTC有一定的診斷效能。此外，我們還分析了miR-1296與腫瘤亞型、ASA分級、性別、甲狀腺球蛋白、病灶數(shù)目的關(guān)系，但未得出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，可能與樣本量較少有關(guān)。

現(xiàn)已報(bào)道的miR-1296靶基因有SRPK1、KEGG等[16，17]。miRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，一個(gè)miRNA可結(jié)合多個(gè)靶基因，且在不同條件下可結(jié)合不同的靶基因[18]。我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MAP17的3′ UTR區(qū)與miR-1296存在15個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。MAP17(DD96，PDZKIP1)是一種相對分子質(zhì)量17 kD的非糖基化的膜相關(guān)蛋白，其過表達(dá)于結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等多種人類腫瘤中。MAP17與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、耐藥等密切相關(guān)[19]。我們通過分析發(fā)現(xiàn)miR-1296與MAP17存在結(jié)合位點(diǎn)，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示在PTC中miR-1296可能通過靶向作用于MAP17發(fā)揮生物學(xué)功能。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，miR-1296在PTC患者腫瘤組織及血清中表達(dá)降低，與PTC的發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)；miR-1296可能通過對其靶基因MAP17的負(fù)性調(diào)控抑制PTC的發(fā)生與進(jìn)展。但本研究樣本量較少，后期我們還需進(jìn)一步加大樣本量、深入分析以驗(yàn)證上述結(jié)論。