不同年生和不同部位人參樣品有效成分的比較

陳麗雪，曲 迪，華 梅，高 坤，孫印石,,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

人參（Panax ginseng C.A. Mey.）是五加科植物人參的干燥根和根莖，具有大補元氣，補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效[1]。人參作為一種傳統(tǒng)藥物已有數(shù)千年的食用和藥用歷史，現(xiàn)代研究表明，人參具有抗癌[2-3]、抗糖尿病[4]、抗衰老[5-6]、抗抑郁[7]、抗炎[8-9]、增強免疫力[10-11]等多種醫(yī)療保健功效，同時也是食品加工、臨床及保健的重要原料[12-14]。人參的多個部位可以作為食用[15-16]和藥用[17-18]，作為典型的多年生草本植物，產(chǎn)品質(zhì)量起伏較大，一直是人們關(guān)注的焦點。

人參的主要活性成分包括皂苷、維生素、多糖、蛋白質(zhì)、有機酸、氨基酸及多肽等[19-23]。近年來，有關(guān)人參的研究主要集中在有效成分的分析及藥理作用上[24-25]，但綜合對比分析人參不同生長年限及不同部位（包括入藥部位和生物學部位）的化學成分差異報道較少。本實驗對比分析不同年生及不同部位人參單體皂苷、總皂苷、總多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)含量，并進行詳細分析，以期為它們的實際應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3～6 a生人參，5 a生人參蘆頭、主根、側(cè)根、須根，莖、葉、花須由吉林中森藥業(yè)種植基地提供，并經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院李偉教授鑒定。將樣品粗粉過篩（60 目），裝袋，標記對應(yīng)名稱3～6 a生人參編號分別為A1、A2、A3、A4；5 a生人參蘆頭、主根、側(cè)根、須根編號分別為B1、B2、B3、B4；5 a生人參根、莖、葉、花編號分別為C1、C2、C3、C4。

人參單體皂苷標準品Rg1、Re、Rf、Rh1、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、香蘭素 上海源葉生物科技有限公司；氨基酸混合標準液（H型） 日本W(wǎng)oke公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Thermo Fisher公司；超純水（Milli-Q Advantage A10超純水器制備）；EDTA基準物質(zhì)、硅藻土、錫箔紙 意大利VELP公司；葡萄糖 國藥集團化學試劑有限公司；苯酚 天津市光復(fù)精細化工研究所；濃硫酸、正丁醇、鹽酸（均為分析純） 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

752N紫外分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；NDA701杜馬斯快速定氮儀 意大利VELP公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀美國Waters公司；MS204S電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q Advantage A10超純水器 美國Millipore公司；低速臺式大容器離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人參單體皂苷的測定

對照品溶液的制備：精密稱取適量人參皂苷對照品，用甲醇溶解配制成人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rh1、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd質(zhì)量濃度分別為0.324、0.288、0.302、0.326、0.224、0.258、0.264、0.270、0.282、0.328 mg/mL的混合對照品溶液，取適量置于進樣瓶，進行上機檢測，得標準品色譜圖（圖1A）。

供試品溶液的制備：準確稱取人參粉末加入25 mL甲醇混合，超聲提取30 min兩次，以8 000 r/min離心5 min，合并提取液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中進行干燥，將干燥物轉(zhuǎn)移到5 mL容量瓶中，并用甲醇定容，用標準人參皂苷或提取樣品的混合物溶解于5 mL甲醇中，過濾到（0.22 μm）樣品瓶中進行分析。采用Acquity UPLC H-級C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）。乙腈和超純水為洗脫劑，采用梯度洗脫法分離人參皂苷，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長203 nm。人參典型樣品色譜圖見圖1B。

圖 1 人參皂苷混合標準品（A）和人參樣品（B）色譜圖Fig. 1 Chromatograms of mixture of gensenoside standards (A) and ginseng sample (B)

1.3.2 人參總皂苷的測定

總皂苷標準曲線的繪制：精密稱取人參皂苷Re對照品10 mg于5 mL容量瓶中，加甲醇適量溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL的人參皂苷Re的標準溶液。取7 支試管依次加入0、20、40、60、80、100、120 μL人參皂苷Re標準溶液，甲醇補充至200 μL，充分混勻后，在80 ℃干燥，加入8%香蘭素和72% H2SO4溶液在60 ℃進行顯色反應(yīng)10 min，放到冷水中10 min，于544 nm波長處測定吸光度，以甲醇為空白對照。以人參皂苷Re標準品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為Y=1.026X-0006 3，R2=0.998 2。

供試品溶液的制備：準確稱取人參粉末0.5 g，加15 mL水飽和正丁醇，在50 ℃超聲提取30 min兩次，以8 000 r/min離心5 min，提取兩次的溶劑合并后與20 mL蒸餾水混合，靜止30 min后，8 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容。取萃取液200 μL至試管中，在80 ℃干燥，加入8%香蘭素和72% H2SO4溶液在60 ℃進行顯色反應(yīng)10 min，然后放到冷水中10 min。以人參皂苷Re作為人參總皂苷的標準品，用紫外分光光度計于544 nm波長處測定吸光度。

1.3.3 人參總多糖的測定

總多糖標準曲線得繪制：精密稱取葡萄糖標準品10 mg于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，配制成1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。取7 支試管依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖標準溶液，蒸餾水補充至2 mL，充分混勻后，依次取出0.5 mL不同質(zhì)量濃度標準品至試管中加入6%苯酚0.5 mL，加入質(zhì)量分數(shù)為98%濃硫酸2.5 mL，室溫放置30 min冷卻，于490 nm波長處測定吸光度，空白對照以蒸餾水代替糖溶液。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為Y=0.010 6X-0.006 3，R2=0.998 9。

供試品溶液的制備：準確稱取人參粉末0.5 g，加入10 mL蒸餾水在50 ℃超聲提取30 min兩次，將兩次濾液合并獲得上清液，上清液中加入無水乙醇，在4 ℃過夜沉淀，離心后加入50 mL蒸餾水在50 ℃超聲溶解沉淀，取1 mL提取液稀釋10 倍，用苯酚-硫酸比色法測定人參總多糖的含量。用紫外分光光度計于490 nm波長處測定吸光度。

1.3.4 人參氨基酸的測定

氨基酸標準圖譜的繪制：氨基酸混合標準液組分：天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、半光氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg），各組分濃度均為2.5 mmol/L。用0.1 mol/L HCl溶液將混合標準液稀釋1 000 倍，取適量置于進樣瓶，參考標準GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》對標準品進行上機測試，得標準氨基酸色譜圖（圖2A）。設(shè)定通道1（VIS 1）位570 nm波長通道，通道2（VIS 2）位440 nm波長通道，除Pro在VIS 2顯示外，其余16 種氨基酸組分均在VIS 1顯示，人參樣品典型氨基酸色譜圖見2B。

圖 2 氨基酸混合標準品（A）和人參樣品（B）色譜圖Fig. 2 Chromatograms of mixture of amino acid standards (A) and ginseng sample (B)

水解氨基酸試樣制備：準確稱取人參粉末0.5 g，置于35 mL水解管中；加6 mol/L HCl溶液20 mL，擰緊螺旋塞密封；超聲10 min；于恒溫干燥箱中110 ℃水解22 h，水解結(jié)束冷卻至室溫，每管取800 μL至小試管，70 ℃真空干燥揮干溶劑；用0.22 μm水系針頭過濾器過至樣品瓶，上機備用。

1.3.5 人參粗蛋白的測定。

氮量標準曲線的繪制：準確稱取乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic，EDTA）（基準物質(zhì)）0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg，置于錫箔紙中，緊密包裹，用壓樣器排除內(nèi)部空氣，壓實，依次放入儀器自動進樣器樣品槽中，蓋上進樣器蓋子保持密閉空間，上機檢測。以EDTA總氮量為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程Y=1.761 93×10-3+2.998 786×10-4X-1.497 155×10-9X2+1.614 818×10-14X3，R2=0.999 9。

粗蛋白試樣的制備：準確稱取人參粉末50 mg，參照1.3.5節(jié)方法進行上機測試。取壓實的空錫箔紙作為空白試樣。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 19.0和Origin 8.0軟件處理，應(yīng)用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。所有數(shù)據(jù)以 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年生人參有效成分含量

不同年生人參單體皂苷含量如表1所示，人參總皂苷含量如圖3所示，隨著生長年限的增長，人參皂苷含量呈逐年增加趨勢，人參10 種單體皂苷含量分別為9.26、23.72、25.93、30.94 mg/g，均具有顯著性差異（P＜0.05），總皂苷含量分別為24.6、43.39、51.39、59.77 mg/g，且3～4 a生人參間皂苷含量增加最快，隨著參齡的增加，皂苷含量呈逐年上升的趨勢，但增加幅度隨參齡的增加而減少。其中Rg1、Re、Rb1含量隨參齡變化較大，其總量分別占3、4、5、6 a生的65%、64%、77%、76%。

表 1 不同年生及不同部位人參單體皂苷含量Table 1 Ginsenoside contents in ginseng samples from different ages and parts mg/g

人參總多糖含量如圖4所示，3、4、5、6 a生人參的總多糖含量分別為12.48、18.86、22.80、19.84 mg/g，5 a生＞6 a生＞4 a生＞3 a生，且6 a生與4 a生人參沒有顯著差異（P＞0.05），表明3～5 a生人參總多糖隨著參齡的增加呈逐年上升的趨勢，但6 a生多糖含量有所降低；人參氨基酸含量如表2所示，3～6 a生人參的氨基酸含量分別為93.34、71.21、65.77、96.53 mg/g，6 a生＞3 a生＞4 a生＞5 a生，且具有顯著性差異（P＜0.05），表明，3～5 a生人參氨基酸含量隨著參齡的增加呈逐年遞減趨勢，但6 a生含量有所增加，且要高于3 a生人參含量。不同年生人參粗蛋白含量如圖5所示，3～6 a生人參的粗蛋白含量為155.06、156.14、163.89、170.11 mg/g，6 a生＞5 a生＞4 a生＞3 a生，且3 a生與4 a生沒有顯著性差異（P＞0.05），5 a生與6 a生沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖 3 不同年生及不同部位人參總皂苷含量Fig. 3 Total saponin contents in ginseng samples from different ages and parts

圖 4 不同年生及不同部位人參總多糖含量Fig. 4 Total polysaccharide contents in ginseng samples from different ages and parts

圖 5 不同年生及不同部位人參粗蛋白含量Fig. 5 Total crude protein contents in ginseng samples from different ages and parts

2.2 5 a生人參根的不同入藥部位有效成分含量

人參單體皂苷含量如表1所示，蘆頭、主根、側(cè)根、須根中人參10 種單體皂苷含量分別為30.06、24.23、28.11、67.94 mg/g，須根＞蘆頭＞側(cè)根＞主根，但蘆頭與側(cè)根間沒有顯著性差異（P＞0.05）；人參總皂苷含量如圖3所示，蘆頭、主根、側(cè)根、須根中總皂苷含量分別為55.11、45.23、47.14、75.01 mg/g，須根＞蘆頭＞側(cè)根＞主根，但主根和側(cè)根間沒有顯著性差異（P＞0.05），蘆頭和須根間有顯著性差異（P＜0.05）。人參總多糖含量如圖4所示，根的不同入藥部位蘆頭、主根、側(cè)根、須根中總多糖含量分別為25.94、22.39、21.13、24.93 mg/g，蘆頭＞須根＞主根＞側(cè)根，但蘆頭、主根、須根間沒有顯著性差異（P＞0.05）；人參氨基酸含量如表2所示，蘆頭、主根、側(cè)根、須根中氨基酸含量分別為121.76、90.33、95.60、100.26 mg/g，蘆頭＞須根＞側(cè)根＞主根，但主根和側(cè)根間沒有顯著性差異（P＞0.05）；人參粗蛋白含量如圖5所示，蘆頭、主根、側(cè)根、須根中粗蛋白含量分別為193.36、142.15、145.47、154.80 mg/g，蘆頭＞須根＞側(cè)根＞主根，但主根和側(cè)根間沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表 2 不同年生及不同部位人參氨基酸含量Table 2 Amino acid contents in ginseng samples from different ages and parts mg/g

2.3 5 a生人參不同生物學部位有效成分含量測定

人參單體皂苷含量如表1所示，不同生物學部位根、莖、葉、花中人參單體皂苷含量為25.93、5.37、89.81、105.99 mg/g，花＞葉＞根＞莖，均具有顯著性差異（P＜0.05），表明同一年生不同生物學部位中單體皂苷含量差異性很大，且花中單體皂苷含量是莖的19.7 倍；人參總皂苷含量如圖3所示，根、莖、葉、花中總皂苷含量為51.39、23.69、100.65、113.78 mg/g，花＞葉＞根＞莖，均具有顯著性差異（P＜0.05），且花中總皂苷含量是莖中的4 倍。

人參總多糖含量如圖4所示，不同生物學部位根、莖、葉、花中人參總多糖含量分別為22.80、13.46、35.09、31.44 mg/g，葉＞花＞根＞莖，但葉和花間沒有顯著性差異，且花中總多糖含量是莖中的2.3 倍。人參氨基酸含量如表2所示，根、莖、葉、花中人參氨基酸含量分別為65.77、50.23、97.74、137.53 mg/g，花＞葉＞根＞莖，且均具有顯著性差異（P＜0.05），且花中氨基酸含量是莖的2.7 倍。人參粗蛋白含量如圖5所示，5 a生不同生物學部位中粗蛋白含量分別為164.60、84.96、145.41、255.05 mg/g，花＞根＞葉＞莖，均具有顯著性差異（P＜0.05），且花中粗蛋白含量是莖中的3 倍。

3 討 論

3.1 不同年生有效成分的比較

人參的生長年限被認為是影響人參品質(zhì)的重要因素之一。人參的次級代謝產(chǎn)物皂苷是一種固醇類化合物，三萜皂苷，有重要的生物活性，多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)等初級代謝產(chǎn)物在人參的生長發(fā)育過程中必不可少，其也在很大程度上體現(xiàn)人參的營養(yǎng)價值。本實驗從不同年生人參有效成分測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3～6 a生人參10 種單體皂苷含量和總皂苷含量呈逐年上升趨勢，3～4 a生人參中人參皂苷含量增長最快，4～6 a間增加緩慢，且人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量隨著參齡變化較大，人參皂苷的總量隨著參齡的增加而增加，但增加幅度隨著參齡的增長呈減少的趨勢，與石威等[26]的研究結(jié)果一致，說明，人參的生長年限是皂苷含量增加的主要因素之一；人參多糖含量在3～5 a內(nèi)呈遞增趨勢，但6 a生人參總糖含量有所降低，與4 a生含量無明顯差別，與白雪媛等[27]的研究結(jié)果相似，說明人參多糖的積累與參齡非正相關(guān)；人參氨基酸含量在3～5 a內(nèi)成遞減趨勢，但6 a生含量有所增加，且要高于3 a生含量，這與岳彬[28]研究的不同年生人參根中氨基酸含量有增有減結(jié)果一致；人參蛋白含量隨著參齡的增長稍有增加，但增加幅度不明顯，說明生長年限對粗蛋白含量的影響不大。

3.2 5 a生人參不同部位有效成分的比較

根據(jù)衛(wèi)生部[29]規(guī)定，強調(diào)“5 a及5 a以下人工種植參”可以作為新資源食品。通過對5 a生人參根的不同入藥部位和不同生物學部位的營養(yǎng)成分進行分析，結(jié)果表明人參各部位的營養(yǎng)成分較為全面。5 a生人參根的不同入藥部位中須根的單體皂苷和總皂苷含量最高，分別為67.94、75.01 mg/g，且5 a生人參根的不同入藥部位中10 種單體皂苷和總皂苷含量比值分別為蘆頭∶主根∶側(cè)根∶須根=1.2∶1.0∶1.2∶2.8和1.2∶1.0∶1.0∶1.3，表明同一年生人參的不同入藥部位皂苷含量有所差異，且都以主根含量為最低；總多糖、氨基酸、粗蛋白含量均為蘆頭最高，分別為25.94、121.76、193.36 mg/g，且總多糖、氨基酸、粗蛋白的比值分別為蘆頭∶主根∶側(cè)根∶須根=1.2∶1.1∶1.0∶1.2、1.3∶1.0∶1.0∶1.1和1.9∶1.0∶1.7∶3.0，總多糖含量為側(cè)根最低，氨基酸、粗蛋白含量為主根最低，其不同部位的有效成分的含量差異顯著。

5 a生人參不同生物學部位中花的單體皂苷、總皂苷、氨基酸和粗蛋白含量最高，分別為105.99、113.78、137.53、255.06 mg/g，且單體皂苷、總皂苷、氨基酸和粗蛋白比值分別為根∶莖∶葉∶花=4.8∶1.0∶16.7∶19.7、2.2∶1.0∶3.6∶4.0、1.3∶1.0∶1.9∶2.7和1.9∶1.0∶1.7∶3.0，表明同一年生人參的不同入藥部位有效成分含量均有所差異，且都以莖中的含量最低；總多糖含量為葉中最高，為35.09 mg/g，且不同部位的比值為根∶莖∶葉∶花=1.7∶1.0∶2.6∶2.3。

人參皂苷具有重要的生物活性，本研究表明，不同年生及不同部位中皂苷含量為6 a生人參和5 a生人參花中最高，從營養(yǎng)成分更全面的角度分析，亦是6 a生人參和5 a生人參花中營養(yǎng)成分含量更高。人參莖、葉、花等部位研究起步較晚，廣度及深度都遠不及人參根，其相關(guān)質(zhì)量標準，藥理活性評價等內(nèi)容仍待完善。在科研和臨床中人參葉常與人參莖混用，擴大了人參藥材的藥用部位，實現(xiàn)了對珍貴的人參資源的充分利用[30]，且人參須的價格遠低于人參主根的價格，從原料成本角度分析，更適合投料[31]。