標(biāo)本離體固定時(shí)間對(duì)熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HER2基因的影響▲

詹曉芬 王少洪 況麗平 邱曉陽(yáng) 李 帆

(廣東省汕頭市中心醫(yī)院病理科，汕頭市 515031，電子郵箱：2565458852@qq.com)

乳腺癌是嚴(yán)重危害我國(guó)女性健康的惡性腫瘤，每年新增病例約21萬(wàn)，死亡率近10/10萬(wàn)[1]?！度橄侔〩ER2檢測(cè)指南(2014版)》中明確指出，所有乳腺原發(fā)性浸潤(rùn)癌必須檢測(cè)人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)[2]。規(guī)范化的標(biāo)本離體固定時(shí)間是確保乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HER2基因檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵，但在實(shí)際臨床診療工作中并沒(méi)有得到真正的重視。目前國(guó)內(nèi)僅有少許文獻(xiàn)報(bào)告了標(biāo)本離體不同固定時(shí)間檢測(cè)對(duì)細(xì)胞形態(tài)[3]、胃癌HER2檢測(cè)結(jié)果的影響[4]，尚未見(jiàn)關(guān)于不同標(biāo)本離體固定時(shí)間對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HER2基因擴(kuò)增效果影響的報(bào)道。本研究通過(guò)收集不同的離體時(shí)間段內(nèi)固定的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌標(biāo)本，采用熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技術(shù)檢測(cè)HER2基因的表達(dá)情況，并分析不同離體時(shí)間乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌標(biāo)本間HER2基因表達(dá)和擴(kuò)增情況的差異，為優(yōu)化乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HER2基因檢測(cè)流程中規(guī)范標(biāo)本離體固定時(shí)間提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 HER2探針(生產(chǎn)批號(hào)：2016002、2016012、2017010、2018003)由北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)，其是含有HER2基因/第17號(hào)染色體著絲粒(CEP17)的雙色探針。10%中性緩沖福爾馬林固定液(生產(chǎn)批號(hào)：16021603、16091905、17062201、18011705)由廣州維格斯生物科技有限公司生產(chǎn)。Tissue-Tek?VIPTM電腦全封閉脫水機(jī)、Tissue-Tek? Y0213990044全自動(dòng)染色封片機(jī)均購(gòu)自日本櫻花公司；Leica RM2135石蠟切片機(jī)由德國(guó)徠卡公司生產(chǎn)；Olympus BX51熒光顯微鏡由日本奧林巴斯株式會(huì)社生產(chǎn)；S500-24熒光原位雜交儀由美國(guó)ThermoBrite公司生產(chǎn)。

1.2 標(biāo)本來(lái)源及分組 選擇2016年5月至2018年6月間在我院就診的、未接受過(guò)任何治療的原發(fā)性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者116例，乳腺癌的診斷依據(jù)參考乳腺腫瘤最新分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[5]。常規(guī)石蠟切片、伊紅-蘇木精染色流程參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。將每例患者送檢的同一病變部位組織呈書(shū)頁(yè)狀切開(kāi)成5份，根據(jù)標(biāo)本的不同離體時(shí)間，將標(biāo)本分別編入A、B、C、D、E組，各組標(biāo)本離體時(shí)間分別為5 min、30 min、60 min、90 min、120 min。

1.3 方法

1.3.1 FISH法檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織HER2基因：針對(duì)各組對(duì)應(yīng)的標(biāo)本離體固定時(shí)間，采用10.0%中性緩沖福爾馬林固定液將各組標(biāo)本固定24 h后制作常規(guī)組織切片。按文獻(xiàn)[7-9]進(jìn)行FISH檢測(cè)。為保證實(shí)驗(yàn)的可信度，實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)置了陰、陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2 HER2基因檢測(cè)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)[2]：(1)HER2/CEP17比值>2.0時(shí)，或HER2與/CEP17比值<2.0，但平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥6.0均判為HER2陽(yáng)性；(2)HER2/CEP17比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0時(shí)為HER2陰性。

1.3.3 觀察指標(biāo)：(1)熒光顯微鏡下不同離體固定時(shí)間乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。(2)不同離體固定時(shí)間乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織HER2基因陽(yáng)性檢出情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組標(biāo)本熒光鏡檢結(jié)果 熒光顯微鏡下，A、B、C組的細(xì)胞輪廓完整、背景干凈、探針定位精準(zhǔn)，橘紅/綠色熒光信號(hào)呈成簇狀(見(jiàn)圖1A～圖1C)。D、E組的細(xì)胞輪廓逐漸模糊，可見(jiàn)細(xì)胞碎片、核溶解甚至細(xì)胞融合，熒光信號(hào)不規(guī)則甚至消失，橘紅/綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度及數(shù)量較A、B、C組減弱、減少(見(jiàn)圖1D、圖1E)。

圖1 各組標(biāo)本HER2基因熒光鏡檢結(jié)果(FISH法，×1000)

注：細(xì)胞核為深藍(lán)色熒光信號(hào)，CEP17探針為綠色熒光信號(hào)，HER2探針為橘紅色熒光信號(hào)。A～E分別是A～E組乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織熒光鏡檢圖像。

2.2 各組標(biāo)本HER2基因陽(yáng)性檢出情況 A～E組標(biāo)本中HER2基因的陽(yáng)性檢出率分別為28.5%(33/116)、28.5%(33/116)、26.7%(31/116)、15.5%(18/116)、8.6%(10/116)。各組HER2基因的陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.33，P<0.001)；進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，A、B、C組HER2基因陽(yáng)性檢出率均高于D、E組(均P<0.05)。

3 討 論

HER2是一種原癌基因，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、臨床治療與疾病預(yù)后密切相關(guān)[10-11]。在組織標(biāo)本的制備過(guò)程中，規(guī)范的標(biāo)本離體固定時(shí)間是保證乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HER2基因檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)，因此，探討不同離體固定時(shí)間對(duì)FISH法檢測(cè)HER2基因的影響具有重要意義。

本研究中，A、B、C組熒光顯微鏡檢的細(xì)胞輪廓完整性、背景干凈度明顯優(yōu)于D、E組，且橘紅/綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度及數(shù)量呈逐漸下降或者減弱的趨勢(shì)；而在對(duì)不同離體固定時(shí)間標(biāo)本HER2基因陽(yáng)性檢出率的分析中，我們發(fā)現(xiàn)各組乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織的HER2基因陽(yáng)性檢出率具有差異，且A、B、C組HER2基因陽(yáng)性檢出率均高于D、E組(均P<0.05)，而A、B、C組間陽(yáng)性檢出率比較無(wú)差異(P>0.05)，提示采用FISH法檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HER2基因時(shí)，標(biāo)本離體固定時(shí)間在5～60 min內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)真實(shí)、穩(wěn)定，而標(biāo)本離體固定時(shí)間超過(guò)60 min則可能引起偏差。我們認(rèn)為出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是隨著標(biāo)本離體固定時(shí)間的延長(zhǎng)，未及時(shí)固定的組織可發(fā)生自溶及腐爛，細(xì)胞內(nèi)各種成分發(fā)生變性、碎裂，部分DNA結(jié)構(gòu)開(kāi)始出現(xiàn)破壞、消失，出現(xiàn)細(xì)胞碎片、融合、非特異著色、熒光探針強(qiáng)度數(shù)量及定位異相等現(xiàn)象。

本研究結(jié)果顯示，A～C組乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織HER2基因陽(yáng)性檢出率為26.7%～28.5%，與相關(guān)研究[12-14]結(jié)果相似。盡管A～C組HER2基因陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但C組比A、B組均少了2例陽(yáng)性病例，這可能是因?yàn)殡S著標(biāo)本離體時(shí)間的增長(zhǎng)，DNA結(jié)構(gòu)破壞的現(xiàn)象越來(lái)越明顯，從而導(dǎo)致HER2基因陰性的檢測(cè)結(jié)果。因此，我們認(rèn)為在采用FISH法檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HER2基因時(shí)，標(biāo)本離體固定時(shí)間以30 min內(nèi)為佳，最長(zhǎng)不應(yīng)超過(guò)60 min。

綜上所述，標(biāo)本離體固定時(shí)間可影響FISH法檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HER2基因的結(jié)果，標(biāo)本離體固定時(shí)間以30 min內(nèi)為佳，最長(zhǎng)不應(yīng)超過(guò)60 min。本研究存在一定局限性，如研究時(shí)限短、樣本量偏小等，下一步我們將加大樣本量和延長(zhǎng)研究時(shí)限來(lái)驗(yàn)證其結(jié)論。